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申请/专利权人：南开大学
摘要：本发明为基于P2RY11基因突变的发作性睡病模型的构建方法及应用，根据P2Y11核酸序列设计靶位点，靶序列为GGAGAAGAATTGGACCTTTG，进行体外转录合成靶点sgRNA；将靶点sgRNA与zCas9mRNA混合后注入斑马鱼受精卵中，提取基因组DNA进行PCR扩增靶点，将突变靶点注射后胚胎饲养成熟，记为F0代；将成熟的F0代与WT型斑马鱼交配产卵，饲养至成熟记为F1代，切取尾鳍提取基因组DNA，进行PCR扩增，筛选出具有双峰的突变个体；将带有相同突变的成熟F1代成雌雄斑马鱼自交，饲养至成鱼，切取尾鳍提取基因组DNA，进行PCR扩增，获得纯合突变体进行饲养记为F2代。
主权项：1.一种基于P2RY11基因突变的发作性睡病模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤是：第一步、合成靶点sgRNA：根据P2Y11核酸序列设计靶位点，靶序列为GGAGAAGAATTGGACCTTTG，命名为序列67，P2Y11的靶点引物为taatacgactcactataGGAGAAGAATTGGACCTTTGgttttagagctagaa，记为P2RY11T67；并进行体外转录合成靶点sgRNA；第二步、制备zCas9mRNA：将含有zCas9的质粒转化扩增，线性化并体外转录；第三步、显微注射：将第一步的靶点sgRNA与第二步的zCas9mRNA混合后注入斑马鱼受精卵中；第四步、F0突变效率鉴定：收取注射后胚胎提取基因组DNA进行PCR扩增靶点，测序鉴定靶点是否发生突变，将突变靶点注射后胚胎饲养成熟，记为F0代；第五步、F1代饲养并鉴定：将成熟的F0代与WT型斑马鱼交配产卵，饲养至成熟记为F1代，切取尾鳍提取基因组DNA，进行PCR扩增靶点上下游序列含靶点，测序筛选出具有双峰的突变个体；第六步、F2代饲养并鉴定：将带有相同突变的成熟F1代成雌雄斑马鱼自交，收集胚胎，饲养至成鱼，切取尾鳍提取基因组DNA，进行PCR扩增靶点上下游序列含靶点，送测序鉴定基因型筛选，获得纯合突变体进行饲养记为F2代，此时F2代为F2-67纯合突变体，获得1型发作性睡病动物模型。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 南开大学 基于P2RY11基因突变的发作性睡病模型的构建方法及应用
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