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申请/专利权人：华南农业大学;广东兆华航天育种创新研究院

摘要：本发明提供了一种检测水稻单细胞基因序列变异的方法及其应用，属于农业技术领域。本发明中的方法主要包括取样、测序和生信分析三方面，其中取样获取的是单个水稻小孢子性细胞。本发明成功分离出单个水稻小孢子性细胞，并对已有水稻单细胞变异检测技术流程所存在的完整性不强、检测连贯性有待提升等缺陷进行了完善，此外还通过重离子诱变技术，鉴定确认了变异位点的真实性。本发明中的方法拓宽了水稻单细胞诱变材料的来源范围，为创制更多样的育种材料、进行更高效的诱变育种提供了新的思路和方法。同时小孢子性细胞作为雄配子，基因组携带的突变能够通过杂交进入子代，可实现变异的遗传和固定，也为优异变异基因的快速利用提供了途径。

主权项：1.一种检测水稻单细胞基因序列变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：1单细胞分离和DNA扩增：先通过拉尖的玻璃毛细管连接微量注射器制作的简易单细胞分离装置，吸取单个存活的单核早期小孢子，然后基于MDAPhi29DNA聚合酶等温扩增体系，使用单细胞全基因组扩增试剂盒进行单细胞DNA扩增；2全基因组测序和数据过滤：先把基因组DNA打成DNA片段进行平末端修复，然后在DNA片段两端连接dA尾，并连接测序接头，随后通过磁珠进行纯化，再选择300-400bp范围的片段进行PCR扩增、纯化、质检以及上机测序，最后使用软件fastp过滤；3单细胞基因组的真实变异鉴定：使用软件GATK进行变异检测，按照单倍型的方法获取SNP位点，让软件根据测序reads的情况直接判断该位点的碱基类型，输出该位点碱基类型；取测序深度100×时，杂合率为0.4-0.6的位点作为杂合突变位点；在此范围外的位点，校正为对应的高频碱基的纯合位点；在此过程中还要去除因为基因组背景差异和DNA扩增过程错配两方面原因造成的假阳性数据，以及使用重离子或γ射线诱变技术对小孢子基因序列变异进行验证；4单细胞基因组变异的偏好性分析：从单细胞测序结果中筛选高频突变基因HMG、低频突变基因LMG和无突变基因NMG，在HMG中，SNP的数量和基因的长度具有极显著的正相关关系，为了排除基因的长度对SNP数量的影响，以SNP比例作为筛选指标，SNP比例为单位长度bp的SNP数量；5单细胞基因组变异的生物信息学分析：包括a.GO富集分析和b.数据分析和绘图。

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