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申请/专利权人：复旦大学

摘要：本发明公开了一种基于RCA‑CRISPRCas12a的一体化核酸检测方法，属于核酸检测技术领域。本发明使用单链DNA挂锁探针识别靶标，通过RCA扩增来进行序列放大，利用Cas12a和crRNA组装的复合物识别并结合RCA扩增的特异产物上的序列来激活Cas12a的反式切割活性，从而切割单链DNA报告分子产生荧光，将靶标的基因信息转换为了可视化的荧光变化，同时在连接反应中利用T4连接酶在DNA3’末端较高的特异性，可实现对单核苷酸突变的特异性检测。本发明将挂锁连接、RCA扩增与CRISPRCas12a切割三个体系结合到一管反应中，同时本发明中使用的RCA扩增反应形成的扩增产物为单链DNA，可以被Cas12a‑crRNA复合物识别无需PAM位点存在，实现了无PAM序列依赖的可视化、一体化核酸检测方法。

主权项：1.一种基于RCA-CRISPRCas12a的一体化核酸检测方法，其特征在于：其检测方法为；首先将待检测核酸样本加入RCA-CRISPRCas12a一体化核酸检测体系中在37℃反应30～60min，在通过蓝光灯直接观察体系荧光变化进行样本检测；最终成像发黄绿色荧光说明含有目标样本，不发光说明不含目标样本；所述RCA-CRISPRCas12a一体化核酸检测体系，反应体系中：作为挂锁探针的单链DNA浓度为1μM、T4连接酶浓度为20Uμl、dNTP浓度为0.6μM、phi29DNA聚合酶浓度为0.5Uμl、Cas蛋白浓度为0.25μM、crRNA浓度为1μM、单链DNA报告分子浓度为1μM；所述RCA-CRISPRCas12a一体化核酸检测体系，反应体系中crRNA的识别序列为挂锁探针的互补序列，在挂锁探针识别、连接并启动RCA扩增前crRNA无结合位点因而Cas蛋白无法发挥作用产生信号，只有存在靶点时，探针才会连接并启动扩增过程，为crRNA提供识别序列，进而激活Cas酶切割报告子发出荧光；利用RCA扩增形成的单链被Cas12a-crRNA复合物识别无需PAM的特点，实现了无PAM序列依赖的可视化、一体化核酸检测方法；所述RCA-CRISPRCas12a一体化核酸检测体系，反应体系中将需要检测的靶标突变碱基的互补位点设计在挂锁探针的3’末端，利用T4连接酶在DNA3’末端较高的特异性，可实现对单核苷酸突变的特异性检测。

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百度查询： 复旦大学 一种基于RCA-CRISPR/Cas12a的一体化核酸检测方法