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申请/专利权人：中国农业科学院植物保护研究所

摘要：本发明的一种利用非靶标生物蛋白预测农药对非靶标生物毒性的方法属于利用非靶标生物蛋白预测农药毒性的方法，该方法通过非靶标生物蛋白的诱导表达与纯化，结合表面等离子共振技术（SPR）和蛋白芯片等先进技术，实现了对农药毒性的高效评估。本发明通过创新性地结合表面等离子共振技术、蛋白芯片技术和人工智能算法，成功替代了传统的非靶标生物毒理实验，实现了更加动物友好、符合伦理的毒性预测方法。凭借高效的样品利用、精准的毒性评估以及简化的实验流程，本发明显著提高了毒性检测的效率和准确性，减少了实验资源的消耗和操作人员的负担。同时，降低了实验成本，提升了高通量检测能力，使得农药毒性评估的整体过程更加便捷和经济。

主权项：1.一种利用非靶标生物蛋白预测农药对非靶标生物毒性的方法，其特征在于包括下列步骤：（1）蛋白目地基因的质粒转化构建非靶标生物蛋白质粒，并对非靶标生物蛋白质粒的目的基因进行质粒转化；（2）蛋白目地基因的诱导对经步骤（1）处理的目的基因进行诱导，并收集上清液；（3）蛋白纯化将步骤（2）收集到的上清液进行蛋白纯化，得到蛋白的最终浓度不低于1mgml；（4）蛋白芯片制备a、配置1×PBS-P+蛋白偶联运行缓冲液；b、使用pH1.0-4.0的醋酸钠溶液将经步骤（3）纯化后的蛋白稀释至终浓度80μgmL；c、将pH1.0-4.0的蛋白醋酸钠溶液于-4℃超声排气1-3min；d、将c步骤处理后的蛋白醋酸钠与芯片在运行缓冲液中进行偶联，偶联量为8000-12000RU，固定于芯片表面待用；其中，偶联量根据公式：得到，其中，Rmax为芯片表面最大结合容量，在蛋白测试中代入100RU；Sm为化学计量比，未知时选择1；RL为配体偶联水平；analyteMW为蜜蜂嗅觉蛋白的分子量，ligandMW为待测农药样品的分子量；（5）农药配置将制备好的农药样品母液向下稀释11个浓度梯度，分别是3000μmolL,1000μmolL,333.3μmolL,111.1μmolL,37μmolL,12.3μmolL,4.1μmolL,1.37μmolL,0.46μmolL,0.15μmolL,0.05μmolL；备用；（6）检测动物蛋白与农药动力学将BiacoreT200生物分子相互作用分析仪的温度设置分别为21℃，28℃，35℃，将步骤（4）中封装好的芯片置于芯片放置槽，仪器参数设置：赫兹数设为10Hz，上样速度为10μlmin，结合时间为120s，解离时间为130s，芯片再生条件为以pH1.8浓度为10mmolL的盐酸甘氨酸溶液以30μlmin的流速再生30s；（7）数据处理a、打开步骤（6）中BiacoreT200生物分子相互作用分析仪的数据分析软件BiacoreT200EvaluationSoftware，点file中的open找到文件；b、打开软件前端界面，点击“数据处理”按键；c、软件基于Sikuli库，通过图像识别来找到和控制界面上的按钮，自动点击solventcorrection进行溶剂校正分析识别溶剂矫正；d、在KineticsAffinity-SelectCurves界面的Selectevaluationmode下面识别并选择Singlemode；在Curve一栏中Sample的下拉栏中可以选择待分析的样品；识别选取步骤（5）中配置好的浓度不同农药样品进行检测，自动判断异常值结果，将此浓度前的对号勾掉，以删除此浓度；e、选择动力学进行拟合，Model选择1：1Binding，Rmax选择fitlocal，接着点击Fit进行数据的拟合；动力学拟合结束后，再进行热力学拟合，得到待测化合物和蛋白的结合常数Ka、解离常数Kd、平衡解离常数KD、弛豫时间tc、自由能ΔG；稳态结合水平Req对分析物浓度C的图计算1：1相互作用的平衡解离常数KD的方程包括如下： ； ；其中：KD为平衡解离常数M；Rmax为表面分析物结合能力RU；offset为样品中的体折射率贡献；质量传递常数中与流速无关的分量，通过如下方程计算： ；其中D是分析物的扩散系数、f是溶液通过流动池的体积流速、h、w、l是流动池尺寸； ；其中G是从表面浓度到RU的转换因子，对于传感器芯片CM5上的蛋白质，G值约为109； ；对于平衡态热力学，范特霍夫方程表示： ；其中ΔG°是标准吉布斯自由能变化、R是普适气体常数、T是绝对温度、KD是平衡解离常数；（8）模型构建a、将非靶标生物毒性数据库查询到、文献中检索到、以及一些类似化合物对蜜蜂毒性生测实验获得的数据，引入数据集；b、将（7）中e步骤得到的结合常数Ka、解离常数Kd、平衡解离常数KD、弛豫时间tc、自由能ΔG作为数据集，并将该数据集按8:2划分为训练集和测试集；c、基于贝叶斯优化算法全局优化超参数，并构建基于XGBoost对蜜蜂毒性预测回归模型；所述的模型架构：定义以下特征变量: ；目标变量: ；使用平方误差损失函数来进行回归任务,定义为,其中y是实际值,是预测值，XGBoost采用了梯度提升框架,通过逐步添加弱学习器来提升模型性能，在第t次迭代时，模型如下: ；其中是第t棵树，目标是最小化损失函数: ；贝叶斯优化用于选择XGBoost模型的最佳超参数，贝叶斯优化通过最大化期望改进来找到最优超参数: ；其中是当前模型的预测,是当前最优解；通过贝叶斯优化找到了最优超参数,并用来训练XGBoost模型: ；其中T是总树的数量，是第t棵树，对新数据进行预测时，将特征变量X输入到训练好的模型中,得到预测值： ；e、将测试集代入模型进行验证，优化模型；f、预测时，将通过BiacoreT200生物分子相互作用分析仪检测的待测农药样品的结合常数Ka、解离常数Kd、平衡解离常数KD、弛豫时间tc、自由能ΔG数值输入模型中，即可得到新化合物对非靶标生物毒性的LD50值，得到毒性等级，完成其毒性的预测。

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