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申请/专利权人：肽源(广州)生物科技有限公司
摘要：本发明涉及一种在毕赤酵母中高效分泌表达全链长胶原蛋白的方法及其应用。包括以下过程：扩增III型胶原片段col3a1及载体片段pPIC9k，以无缝克隆的方式连接，获得载体pPIC9k‑col3a1，筛选毕赤酵母中超过100kDa分子量的分泌蛋白，将其信号肽序列与酿酒酵母α‑杂交因子前导肽融合，筛选出载体pPIC9K‑SigG‑col3a1，筛选分子伴侣表达载体pPICZaA‑SH1，将其导入GS115pPIC9k‑SigG‑col3a1感受态细胞。本发明可用于全链长胶原蛋白的分泌表达，解决了大分子蛋白，尤其是含端肽胶原蛋白在毕赤酵母中难以分泌或者分泌量低的问题。
主权项：1.一种在毕赤酵母中高效分泌表达全链长III型胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、PCR扩增获得胶原蛋白氨基酸序列对应的核苷酸序列与线性化载体片段pPIC9k；S2、利用无缝克隆将步骤S1获得的胶原蛋白氨基酸序列对应的核苷酸序列与线性化载体片段pPIC9k连接，获得重组载体；S3、搜集毕赤酵母自身超过100kDa分子量的分泌蛋白，通过将毕赤酵母自身信号肽与酿酒酵母α-杂交因子前导肽进行融合，筛选获得新的信号肽SigG；S4、将步骤S3获得的新的信号肽SigG与步骤S2所得重组载体以无缝克隆的方式插入替换信号肽部分，构建载体，利用SacII将载体线性化，进一步电转化导入GS115，筛选出感受态细胞；S5、构建分子伴侣表达载体pPICZaA-SH1，并将其导入步骤S4筛选出的感受态细胞中进行表达，即得；所述在毕赤酵母中高效分泌表达的全链长胶原蛋白为包含成熟链前后端的III型前导肽；步骤S3所述新的信号肽SigG的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
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