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申请/专利权人：浙江隆基生物技术有限公司
摘要：本发明涉及生物工程领域，公开了一种GS双等位基因敲除的CHO‑K1单克隆细胞株的制备方法。本发明将Cas9和sgRNA递送到CHO细胞中，这种方式不向细胞中引入任何含抗性基因和筛选基因的载体，可避免对CHO细胞造成损伤。RNP复合体会被降解，没有被整合到宿主基因组的可能性。最后，RNP复合体因为不需要在细胞内经过翻译得到Cas9蛋白的过程，一旦被递送入细胞就可以开始作用，因此能得到较高的切割效率。此外，本发明方法可避免构建昂贵且耗时的质粒载体，可缩短GS敲除的周期。综上，本发明方法更加适用于CHO细胞，特别是敲除GS基因后的CHO细胞被用于生物药品和原料生产中，将更加安全实用。
主权项：1.一种GS双等位基因敲除的CHO-K1单克隆细胞株的制备方法，其特征在于包括：1）分析CHO-K1细胞5号、1号染色体上GS基因，制定敲除方案并设计识别GS基因的Cas9引导sgRNA序列；2）在20ntsgRNA序列后连上tracrRNA序列，合成PCR反应引物；3）PCR扩增得到sgRNA体外转录模版；4）通过RNA聚合酶体外转录获得包含sgRNA序列和tracrRNA序列的sgRNA；5）将sgRNA与Cas9蛋白结合形成RNP复合体，转染入CHO-K1细胞中；6）单克隆培养，获得GS双等位基因敲除的CHO-K1单克隆细胞株。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 浙江隆基生物技术有限公司 一种GS双等位基因敲除的CHO-K1单克隆细胞株的制备方法
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