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申请/专利权人：青岛大学

摘要：本发明涉及一种磷酸二酯酶抑制剂及高通量筛选方法。磷酸二酯酶PDE与情绪、记忆和认知功能等多种生理活动相关，是重要的疾病靶点。现有磷酸二酯酶抑制剂的筛选方法存在成本高昂、无法实现高通量筛选等技术缺陷。本发明提供了一种低成本、高通量的筛选方法，通过荧光素酶表达载体转染HEK293T细胞，使其单一、稳定的高表达结合cAMP或cGMP的变体荧光素酶作为筛选模型，通过荧光强度快速筛选具有抑制活性的化合物，将所述抑制活性化合物加入PDE单体蛋白中，判断该PDE抑制剂针对的亚型及药效活性。上述方法以活细胞作为研究模型，更贴近体内的生理活性，可实现低成本的高通量筛选，具有重要的应用前景。

主权项：1.一种磷酸二酯酶抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，所述筛选方法的具体步骤如下：（1）构建变体荧光素酶的表达载体，将该表达载体转染正常细胞，其中所述变体荧光素酶能够特异性结合细胞中的cAMP或cGMP；（2）筛选稳定高表达所述变体荧光素酶的细胞株，加入待测化合物进行培养，并对细胞中的cAMP或cGMP含量进行检测；所述磷酸二酯酶可分为11个亚型，其中，PDE4、7和8主要水解cAMP，PDE5、6和9特异性水解cGMP，而其它PDE对两者没有选择性；所述筛选方法是基于磷酸二酯酶11个亚型中的多种或者同时存在的条件下进行的筛选；所述筛选方法是指对具有水解cAMP或cGMP活性的相关磷酸二酯酶亚型的抑制剂进行筛选；所述筛选方法可以对化合物的PDE抑制活性进行有效的区分；所述表达载体转染过程中加入荧光素酶底物和cAMP或cGMP激动剂；所述cAMP激动剂为Forskolin；所述cGMP激动剂为S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine；所述Forskolin的加入是通过向每个实验孔中加入10uL、浓度为100uM的Forskolin溶液；所述S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine的加入是通过向每个实验孔中加入10uL、浓度为250uM的SNAP溶液；步骤（2）中：表达载体为荧光素酶表达载体，通过荧光强度检测测定cAMP、cGMP含量；检测步骤具体如下：将向高表达cAMP、cGMP的细胞株中分别加入阳性药物及待测化合物，比较待测化合物组及阳性药物组的荧光强度，荧光强度越高表明该待测化合物磷酸二酯酶抑制活性越强；所述筛选方法还包括如下步骤：构建编码不同PDE亚型的重组质粒，令其在大肠杆菌中高度表达各亚型的PDE蛋白，采用蛋白纯化技术得到各亚型蛋白单体；将上述基于荧光强度筛选得到的活性化合物作用于各亚型的PDE蛋白，通过HPLC技术测定水解底物的量，从而确认化合物作用的PDE亚型。

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百度查询： 青岛大学 一种磷酸二酯酶抑制剂的高通量筛选方法