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申请/专利权人：北京锦篮基因科技有限公司;北京五加和基因科技有限公司

摘要：本发明涉及无弹状病毒污染的Sf9细胞株的筛选方法和驯化方法，以及通过所述筛选方法和驯化方法获得的无弹状病毒污染的Sf9细胞株。本发明还涉及无弹状病毒污染的低耗氧及低耗糖的Sf9细胞株的筛选方法，以及通过所述筛选方法获得的无弹状病毒污染的低耗氧及低耗糖的Sf9细胞株。本发明的无弹状病毒污染的Sf9细胞株在发酵培养时，表现出低耗氧及低耗糖的特性，用于在重组蛋白或病毒载体如AAV病毒载体的生产中降低生产成本并降低Sf9细胞生产的生物制品的安全性风险。

主权项：1.一种无弹状病毒污染的Sf9细胞株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：1制备细胞悬液：将受弹状病毒污染的Sf9细胞在补充有5％－20％FBS的基础无血清昆虫细胞培养基中培养后，制备细胞悬液；2制备单克隆筛选培养液：使用补充有乳清蛋白水解物和Yeastolate的第一基础无血清昆虫细胞培养基30%-60%、第二基础无血清昆虫细胞培养基20%-35%和FBS10%-35%制备单克隆筛选培养液，其中，所述第一基础无血清昆虫细胞培养基与所述第二基础无血清昆虫细胞培养基相同或不同，且独立地选自任何基础无血清昆虫细胞培养基；3细胞悬液的稀释和铺板离心步骤1获得的细胞悬液并用基础无血清昆虫细胞培养基多次清洗细胞，以去除含弹状病毒的培养液；然后取步骤2新鲜配制的单克隆筛选培养液，将细胞稀释至0.1×104个ml－1×106个ml，然后再进行梯度稀释，至每毫升25－100个细胞，按照1－10个细胞每孔，接种于培养板中，放置在27－28℃的恒温培养箱中静置培养；或者离心步骤1获得的细胞悬液并用基础无血清昆虫细胞培养基多次清洗细胞，以去除含弹状病毒的培养液；然后取步骤2新鲜配制的单克隆筛选培养液并添加抗病毒化合物，使抗病毒化合物的终浓度为10－50ngml，将细胞稀释至0.1×104个ml－1×106个ml，然后再进行梯度稀释，至每毫升25－100个细胞，按照1－10个细胞每孔，接种于培养板中，放置在27－28℃的恒温培养箱中静置培养；4细胞培养、弹状病毒检测和细胞传代铺板后第二天－第十天，每天观察孔板，从中寻找单细胞孔；对该通过有限稀释得到的单克隆细胞孔定期观察细胞生长情况，同时进行弹状病毒检测，根据细胞生长情况及弹状病毒检测结果，对孔板细胞换液或扩大培养和传代，其中换液是更换培养液为培养各孔板细胞所对应的单克隆筛选培养液或者添加有终浓度为10－50ngml抗病毒化合物的单克隆筛选培养液；5扩大培养无弹状病毒污染的细胞对步骤4获得的初步检测无弹状病毒污染的细胞使用各孔板细胞所对应的单克隆筛选培养液或者添加有终浓度为10－50ngml抗病毒化合物的单克隆筛选培养液扩大培养；进行弹状病毒检测，获得无弹状病毒污染的Sf9细胞株。

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