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申请/专利权人：伊玛提克斯生物技术有限公司

摘要：本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞和转入患者的疫苗复合物的活性药物成分联合使用的肿瘤相关T细胞CTL肽表位。与主要组织兼容性复合体MHC分子结合的肽或与此同类的肽也可能是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。

主权项：1.一种肽，其由氨基酸序列SEQIDNo.157组成；或其一种药用盐。

全文数据：用于各种肿瘤免疫治疗的新型肽和肽组合物[0001]本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞和转入患者的疫苗复合物的活性药物成分联合使用的肿瘤相关T细胞CTL肽表位。与主要组织兼容性复合体MHC分子结合的肽或与此同类的肽也可能是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。[0002]本发明涉及数种新型肽序列及其变体，它们源自人肿瘤细胞的HLA-I类分子，可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中或作为开发药物免疫活性化合物和细胞的目标。[0003]发明背景[0004]根据世界卫生组织WHO的资料，癌症是2012年全球范围内四大非传染性致命疾病之一。同年，结直肠癌、乳腺癌和呼吸道癌症在高收入国家被列为前10位死亡原因内http:www.who.intmediacentrefactsheetsfs310en。[0005]流行病学[0006]2012年，估计全球有1410万新增癌症病例，3260万癌症患者5年之内确诊），820万癌症死亡病例（Ferlayetal·，2013;Brayetal·，2013〇[0007]在脑癌、白血病和肺癌群体内，本发明特别分别着重于胶质母细胞瘤GB、慢性淋巴细胞白血病CLL和急性骨髓性白血病AML、非小细胞和小细胞肺癌NSCLC和SCLC。[0008]GB是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，在美国，年龄调整的发病率为每10万居民3.19名。GB的预后极差，1年生存率为35%，5年生存率低于5%。男性性别、较大年龄和种族似乎是GB的危险因素Thakkaretal.，2014。[0009]CLL是西方世界最常见的白血病，其中大约占全部白血病病例的三分之一。美国和欧洲的发病率相似，估计每年新发病例约有16，000名。CLL在白种人中比非洲人更常见，在西班牙裔和土著美国人中较罕见，在亚洲人中很少见。在亚洲血统的人群中，CLL的发生率比白种人低3倍Gunawardanaetal.，200810勵.：67-从左至右的组织：7癌组织（4脑癌，2肺癌，1子宫癌），图IH基因：CCDC138，肽:FLLEREQLLSEQIDNO.:84-从左至右的组织：3细胞系（2血细胞，1皮肤），24癌组织（1骨髓细胞癌，3白细胞白血病癌症，1骨髓癌，1乳腺癌，1肾癌，2结肠癌，3直肠癌，1肺癌，7淋巴结癌，3膀胱癌，1子宫癌），图II基因：CLSPN，肽：SLLNQPKAVSEQID勵.：235-从左至右的组织：13细胞系（3血细胞，2肾，8胰腺），30癌组织（1骨髓细胞癌，1白细胞白血病癌症，2脑癌，2乳腺癌，2食管癌，1胆囊癌，1直肠癌，2肝癌，4肺癌，5淋巴结癌，2卵巢癌，2皮肤癌，4膀胱癌，1子宫癌），图1J基因：SPC25,肽:GLAEFQENVSEQIDNO.:243-从左至右的组织：3细胞系（1血细胞，1肾，1胰腺），67癌组织（1胆管癌，4白细胞白血病癌症，1骨髓细胞癌，2脑癌，3乳腺癌，4食管癌，2胆囊癌，2结肠癌，1直肠癌，2肝癌，15肺癌，8淋巴结癌，9卵巢癌，3皮肤癌，4膀胱癌，6子宫癌。[0447]图2显示了本发明的源基因的代表性表达特征（与正常肾脏相比的相对表达），这些基因在与一系列正常组织相比在不同癌症中高度过度表达或专门表达。图2APRIM2,从左到右的组织：肾上腺、动脉、骨髓、脑（全部）、乳腺、结肠、食管、心脏、肾（三份）、白细胞、肝、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、唾液腺腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、膀胱、宫颈、子宫、静脉每个正常样本代表几个供体的库）、22个前列腺癌样本，图2BCHEKl-从左到右的组织：肾上腺、动脉、骨髓、脑全部）、乳腺、结肠、食管、心脏、肾（三份）、白细胞、肝、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、唾液腺腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、膀胱、宫颈、子宫、静脉每个正常样本代表几个供体的库）、3个正常结肠样本，10个结直肠癌样本，图2CTTC30A-从左到右的组织：肾上腺、动脉、骨髓、脑（全部）、乳腺、结肠、食管、心脏、肾三份）、白细胞、肝、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、唾液腺腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、膀胱、宫颈、子宫、静脉每个正常样本代表几个供体的库）、30个脑癌样本，图2DTRIPl3-从左到右的组织：肾上腺、动脉、骨髓、脑全部）、乳腺、结肠、食管、心脏、肾三份）、白细胞、肝、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、唾液腺腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、膀胱、宫颈、子宫、静脉每个正常样本代表几个供体的库）、1个正常肺样本，38个肺癌样本，图2EMXRA5-从左到右的组织：肾上腺、动脉、骨髓、脑全部）、乳腺、结肠、食管、心脏、肾（三份）、白细胞、肝、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、唾液腺腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、膀胱、宫颈、子宫、静脉每个正常样本代表几个供体的库）、9个胰腺癌样本。图2F至H显示了本发明的源基因的代表性表达特征，这些基因在一系列正常组织（白色柱）的癌症中以及不同癌症样本黑色柱）中高度过度表达或专门表达。图2FMMPll，MMP13SeqIDNo24-从左至右的组织:80正常组织样本6动脉，2血细胞，2大脑，1心脏，2肝，3肺，2静脉，1脂肪组织，1肾上腺，5骨髓，1软骨，1结肠，1食管，2眼，2胆囊，1肾脏，6淋巴结，4胰腺，2末梢神经，2脑下垂体，1直肠，2唾液腺，2骨骼肌肉，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1甲状腺，7气管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，5胎盘，1前列腺，1睾丸，1胸腺，1子宫），50癌样本10乳腺癌，4胆管癌，6胆囊癌，11食管癌，10膀胱癌，10子宫癌），图2GH0RMAD1SEQIDNO168-从左到右的组织:80正常组织样本6动脉，2血细胞，2大脑，1心脏，2肝，3肺，2静脉，1脂肪组织，1肾上腺，5骨髓，1软骨，1结肠，1食管，2眼，2胆囊，1肾脏，6淋巴结，4胰腺，2末梢神经，2脑下垂体，1直肠，2唾液腺，2骨骼肌肉，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1甲状腺，7气管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，5胎盘，1前列腺，1睾丸，1胸腺，1子宫），41癌样本10乳腺癌，10皮肤癌，11非小细胞肺癌，10小细胞肺癌），图2HIGF2BPl，IGF2BP3SeqIDNo274-从左到右的组织：80正常组织样本6动脉，2血细胞，2大脑，1心脏，2肝，3肺，2静脉，1脂肪组织，1肾上腺，5骨髓，1软骨，1结肠，1食管，2眼，2胆囊，1肾脏，6淋巴结，4胰腺，2末梢神经，2脑下垂体，1直肠，2唾液腺，2骨骼肌肉，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1甲状腺，7气管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，5胎盘，1前列腺，1睾丸，1胸腺，1子宫），53癌样本4胆管癌，6胆囊癌，10淋巴结癌，12卵巢癌，11食管癌，10肺癌）。[0448]图3显示了示例性的免疫原性资料:肽特定多聚体染色后流式细胞仪结果。[0449]图4A-R显示上部分:根据技术重复测量值的中值MS信号强度绘制为彩色点，单一HLA-A*02阳性正常组织为绿色或灰色点，检测到该肽的肿瘤样本为红色点。肿瘤和正常样本按照器官起源分组，箱须图代表了多个样本归一化信号强度的中位数，第25和第75百分位箱）以及最小值和最大值须）。正常器官根据风险类别排列顺序血细胞、心血管系统、脑、肝、肺:高风险，深绿色点；生殖器官、乳腺、前列腺:低风险，灰色点;所有其他器官：中等风险;浅绿色点）。下部分:每个器官的相对肽检测频率显示为脊柱图。图表下面的数字表示每个器官分析的总样本数中检测到肽的样本数正常样本N=298,肿瘤样本N=461。如果在一个样本上检测到肽，但因技术原因无法量化，则该样本纳入检测频率图中，但图表上部分不显示任何点。组织从左到右）：正常样本:动脉;血细胞;脑;心;肝;肺;静脉;脂肪:脂肪组织；adren·gl·:肾上腺；BM:骨髓；colorect:结肠和直肠；duod:十二指肠；esoph:食管；galIb:胆囊；LN:淋巴结；pane:胰腺；parathyr:甲状旁腺；perit:腹膜；pituit:垂体；sal·gland:唾液腺;skel·mus:骨豁肌;皮肤;sm·mt:小肠;脾；胃；甲状腺;气管;输尿管;膀胱;乳房;卵巢;胎盘;前列腺;睾丸;胸腺;子宫。肿瘤样本AML:急性髓性白血病;PCA:前列腺癌;BRCA:乳腺癌;CLL:慢性淋巴细胞白血病;CRC:结直肠癌;GALB:胆囊癌;HCC:肝细胞癌；MEL:黑色素瘤;NHL:非霍奇金淋巴瘤;OC:卵巢癌;OSCAR:食管癌;0SC_GC:食管胃癌;PC:胰腺癌;GB:胶质母细胞瘤;GC:胃癌;NSCLC:非小细胞肺癌;RCC:肾细胞癌;SCLC:小细胞肺癌；UBC:膀胱癌;UEC:子宫和子宫内膜癌。[0450]图5A-R显示本发明的源基因的代表性表达特征，其在不同癌症样本中过度表达。肿瘤红色点）和正常绿色或灰色点）样本按照器官起源分组，箱须图代表了中位数、第25和第75百分位箱）以及最小和最大须RPKM值。正常器官根据风险类别排列顺序。RPKM=每百万映射读数每千碱基读数。正常样本:动脉;血细胞;脑；心;肝;肺;静脉;脂肪:脂肪组织;adren.gl.:肾上腺;BM:骨髓;软骨;colorect:结肠和直肠;esoph:食管；眼睛;galIb:胆囊；肾脏;LN:淋巴结；神经;pane:胰腺;pitmt:垂体；sal·gland:唾液腺；skel·mus:骨豁肌；皮肤;sm.mt:小肠;脾；胃；甲状腺;气管;膀胱;乳房;卵巢;胎盘;前列腺;睾丸;胸腺;子宫。肿瘤样本AML:急性髓性白血病;PCA:前列腺癌;BRCA:乳腺癌；CLL:慢性淋巴细胞白血病；CRC:结直肠癌;GALB:胆囊癌;HCC:肝细胞癌;MEL:黑色素瘤;NHL:非霍奇金淋巴瘤;OC:卵巢癌;OSCAR:食管癌;PC:胰腺癌;GB:胶质母细胞瘤;GC:胃癌;NSCLC:非小细胞肺癌;RCC:肾细胞癌;SCLC:小细胞肺癌;UBC:膀胱癌;UEC:子宫和子宫内膜癌。[0451]图6A至M显示了健康HLA-A*02+供体的肽特异性⑶8+T细胞体外反应的示例性结果。CD8+T细胞制备的方法为：使用抗⑶28mAb和HLA-A*02涂层的人工APC分别与例如SeqIDNo11肽A，左图）或SeqIDNo14肽（B，左图）合成（SeqIDNo157C、233〇、85E、89F、155G、153H、264⑴、117J、253K、39L和203M。经过3个周期的刺激后，用相关多聚体，例如，A*02SeqIDNo11㈧或A*02SeqIDNo14⑶的2D多聚体染色法对肽反应性细胞进行检测。右图（例如，A和B显示用不相关A*02肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞在CD8+淋巴细胞上得到门控。Boolean门控帮助排除用不同肽特定的多聚体检测的假阳性事件。提示了特异性多聚体+细胞和CD8+淋巴细胞的频率。[0452]图7A-C显示了与正常组织相比各种肽在不同癌症组织中的过度提呈。分析包括来自320多个正常组织样本以及462个癌症样本的数据。显示的仅是被发现提呈肽的样本。图7A基因：CCR8，肽：LLIPFTIFMSEQIDNO.:43-从左至右的组织：16癌组织（1胆管癌，1乳腺癌，1结肠癌，7肺癌，2淋巴结癌，3卵巢癌，1皮肤癌）；图7B基因：CXCR5，肽：ILVTSIFFLSEQIDNO.:152-从左至右的组织:6正常组织（1淋巴结，5脾），16癌组织8白细胞白血病癌症，8淋巴结癌）；图7C基因：CYSLTRl，肽：VILTSSPFLSEQIDN0.:156-从左至右的组织:3正常组织（1肺，1淋巴结，1脾），11癌组织2乳腺癌，5白细胞白血病癌症，3淋巴结癌，1骨髓细胞癌）。实施例[0453]实施例1[0454]细胞表面提呈的肿瘤相关肽的识别和定量[0455]组织样本[0456]患者肿瘤组织获得自AsterandDetroit，USAandRoyston，Herts，UK、Vald’Hebron大学医院（Barcelona、BioServeBeltsville，MD，USA、癌症免疫治疗中心（CCIT、Herlev医院Herlev!GeneticistInc.Glendale，CA，USA、日内瓦大学医院、海德堡大学医院、慕尼黑大学医院、京都府立医科大学（KPUM、大阪市立大学（0⑶）Jrote0GenexInc.，（CulverCity，CA，USA、蒂宾根大学医院。正常组织获得自Bio-OptionsInc.，CA，USA、BioServe，BeltsviIIe，MD，USA、CapitalBioScienceInc·，RockviIIe，MD，USA、GeneticistInc.，Glendale，CA，USA、日内瓦大学医院、海德堡大学医院、慕尼黑大学医院、ProteoGenexInc.,Culver^〖7,04，1^4、蒂宾根大学医院。所有患者在手术或尸检前都获得了书面知情同意。切除后组织立即进行冷休克处理，在分离TUMP前储存于-70°C或以下。[0457]从组织样本中分离HLA肽[0458]根据方案（Falketal.，1991;Seegeretal.，1999略加修改，使用HLA_A*02特异性抗体BB7.2、HLA-A、HLA-B、HLA-C特异性抗体W632、CNBr活化的琼脂糖凝胶、酸处理和超滤方法以固体组织的免疫沉淀法获得了冷休克组织样本的HLA肽库。[0459]质谱分析[0460]获得的HLA肽库根据其疏水性用反相色谱nanoAcquityUPLCsystem，Waters分离，洗脱肽用装有电喷雾源的LTQ-velos融合杂交质谱ThermoElectron进行了分析。肽库被直接加载填充有1.7μπιC18反相材料Waters的分析用熔炼石英微毛细管柱75μπι内径x250mm，应用流速为400nL每分钟。随后，使用来自流速为300nL每分钟、浓度为10%至33%溶剂B中的两步180分钟二元梯度法对肽进行分离。梯度由溶剂A含0.1%甲酸的水和溶剂B含0.1%甲酸的乙腈）。金镀膜玻璃毛细管PicoTip，NewObjective用于引入到纳升电喷雾源。使用前5T0P5策略在数据依赖模式下操作LTQ-Orbitrap质谱仪。简言之，首先以高精确质量完全扫描在orbitrap开始一个扫描周期R=30000，之后用先前选定离子的动态排除技术在orbitrap中对5种含量最为丰富的前体离子进行MSMS扫描R=7500。串联质谱以SEQUEST和另一种手动控制器进行解读。生成的自然肽破碎模式与合成序列相同参考肽的破碎模式进行比较后，确保了被识别的肽序列。[0461]无标记相对LC-MS定量透过离子计数（即透过LC-MS功能提取和分析）来进行Muelleretal.，2007。该方法假定肽的LC-MS信号区域与样本中其丰度相关。提取的特征透过充电状态去卷积和保留时间校准进行进一步处理Muelleretal.，2008;Sturmetal.，2008。最后，所有的LC-MS特征与序列鉴定结果交叉引用，以将不同样本和组织的定量数据与肽呈递特征结合。定量数据根据集中数据以两层方式进行正态化处理，以说明技术和生物学复制变异。因此，每个被识别的肽均可与定量资料相关，从而可得出样本和组织之间的相对定量。此外，对候选肽获得的所有定量数据进行手动检查，以确保数据的一致性，并验证自动化分析的准确度。对于每种肽，计算了提呈图，其显示样本平均提呈量以及复制变化。这些特征使胰腺癌样本与正常组织样本的基线值并列。示范性过度提呈肽的提呈谱示于图1中。选定肽在各种实体中提呈概述见表4。[0462]表4:选定肽在各种实体中提呈概述。如果一种肽相比于正常组织在一种实体癌样本上过度提呈，则认为与该实体相关。MEL=黑色素瘤，BRCA=乳腺癌，OSCAR=食管癌。BPH包括良性前列腺增生以及胰腺癌。[0463][0468]表4B:选定肽在各种实体中提呈概述。[0469]GB=胶质母细胞瘤，BRCA=乳腺癌，CRC=结直肠癌，RCC=肾细胞癌，CLL=慢性淋巴细胞性白血病，HCC=肝细胞癌，NSCLC=非小细胞肺癌，SCLC=小细胞肺癌，NHL=非霍奇金淋巴瘤，AML=急性骨髓性白血病，OC=卵巢癌，PC=胰腺癌，BPH=前列腺癌和良性前列腺增生，OSCAR=食管癌，包括胃食管交界处癌，GBCJXC=胆囊腺癌和胆管癌，MEL=黑色素瘤，GC=胃癌，UBC=膀胱癌，UTC=子宫癌。[0470][0477]实施例2[0478]编码本发明肽的基因的表达谱[0479]与正常细胞相比在肿瘤细胞上一种肽过度提呈或特定提呈足够其在免疫治疗中有效使用，一些肽为肿瘤特异性的，尽管存在其源蛋白也存在于正常组织中。但是，mRNA表达谱增加了免疫治疗目标肽选择中其他级别的安全性。特别是对于具有高安全性风险的治疗选择，诸如亲和力成熟的TCR，理想的目标肽将来源于对该肿瘤独一无二且不出现于正常组织中的蛋白。对于本发明，根据上述涵盖大约3000个正常组织样本RNA表达数据的数据库，所有源基因的正常组织表达被证明是最小的。在一些癌症实体病例（HCC、CRC、GB、GC、NSCLC、PC、RCC、BPHPCA中加入正常组织和肿瘤组织的进一步RNA分析以估算各癌症患者群体的靶标范围。[0480]RNA来源与制备[0481]手术切除组织标本按如上所述参见实施例1在获得每名患者的书面知情同意后提供。手术后立即速冻肿瘤组织标本，之后在液态氮中用杵臼匀浆。使用TRI试剂Ambion公司，Darmstadt，德国）之后用RNeasyQIAGEN公司，Hilden，德国）清理从这些样本中制备总RNA;这两种方法都根据制造商的方案进行。[0482]健康人体组织中的总RNA从商业途径获得（Ambion公司，Huntingdon，英国；Clontech公司，海德堡，德国；Stratagene公司，阿姆斯特丹，荷兰;BioChain公司，Hayward，CA，美国）。混合数个人2至123个人的RNA，从而使每个人的RNA得到等加权。[0483]所有RNA样本的质量和数量都在Agilent2100Bioanalyzer分析仪Agilent公司，Waldbronn，德国）上使用RNA6000PicoLabChipKit试剂盒Agilent公司）进行评估。[0484]健康人体组织中的总RNA从商业途径获得（Ambion公司，Huntingdon，英国；Clontech公司，海德堡，德国；Stratagene公司，阿姆斯特丹，荷兰;BioChain公司，Hayward，CA，美国）。混合数个人2至123个人）的RNA，从而使每个人的RNA得到等加权。所有RNA样本的质量和数量都在Agilent2100Bioanalyzer分析仪Agilent公司，Waldbronn，德国）上使用RNA6000PicoLabChipKit试剂盒Agilent公司）进行评估D[0485]用于RNASeq实验来自健康人体组织的总RNA获得自：AsterandDetroit，MI，USARoyston，Herts，UK、BioCatGmbHHeidelberg,Germany、BioServeBeltsvilie，MD，USA、CapitalBioScienceInc.Rockville，MD，USA、GeneticistInc·Glendale，CA，USA、IstitutoNazionaleTumori〃Pascale〃（Naples，Italy、ProteoGenexInc.CulverCity，CA，USA、海德堡大学医院Heidelberg，GermanyD[0486]用于RNASeq实验来自肿瘤组织的总RNA获得自：AsterandDetroit，MI，USARoyston，Herts，UK、Bio_0ptionsInc.Brea，CA，USA、BioServeBeltsville，MD，USA、GeneticistInc.Glendale?CA?USA^ProteoGenexInc·CulverCity，CA，USA、TissueSolutionsLtdGlasgow，UK、波恩大学医院（Bonn,Germany、海德堡大学医院Heidelberg，Germany、蒂宾根大学医院（Tiibingen，Germany。[0487]微数组实验[0488]范围透过分析30GB、16CRC、56RCC、12HCC、38NSCLC、11PC、34GC和20个前列腺癌样本的1?熟表达谱八££丫1116丨1^1微列阵进行估计。[0489]所有肿瘤和正常组织的RNA样本都使用AffymetrixHumanGenomeHGU133A或HG-U133Plus2.0Affymetrix寡核苷酸芯片（Affymetrix公司，SantaClara，CA，美国）进行基因表达分析。所有步骤都根据Affymetrix手册进行。简言之，如手册中所述，使用SuperscriptRTIIInvitrogen公司）以及oligo-dT_T7引物（MWGBiotech公司，Ebersberg，德国）从58ugRNA中合成双链HighYieldRNATranscriptLabellingKitENZODiagnostics公司，Farmingdale，NY，美国）进行Ul33A测定或用GeneChipIVTLabellingKitAffymetrix公司）进行U133Plus2.0测定，之后用链霉亲和素-藻红蛋白和生物素化抗链霉素蛋白抗体MolecularProbes公司，Leiden，荷兰进行破碎、杂交和染色，这样完成体外转录用Agilent2500AGeneArrayScannerU133A或AffymetrixGene-ChipScanner3000U133Plus2.0对图像进行扫描，用GCOS软件Affymetrix公司）在所有参数默认设置情况下对数据进行分析。为了实现标准化，使用了Affymetrix公司提供的100种管家基因（housekeepinggene相对表达值用软件给定的signallogratio进行计算，正常肾组织样本的值任意设置为l.L本发明的代表性源基因在!1：：、0?：、68、6：、吧^：、？：、1^：、8?!1八^八中高度过度表达的表达谱如图2所示。选定肽源基因的目标范围概述见表。[0490]表5A:选定肽源基因的目标范围。过度表达被定义为相比最高表达该基因的相关正常组织，在肿瘤上的表达超过1.5倍。70%=IV。如果一种肽能够从多个源基因获得，最少范围的基因则是决定性的。[0495]RNAseq实验[0496]透过新一代测序技术RNAseq由CeGaTTiibingen，Germany对肿瘤和正常组织的RNA样本进行基因表达分析。简言之，根据供货商的方案（IlluminaInc.，SanDiego，CA，USA，其中包括RNA碎片化、cDNA转化和测序适配器的加入，利用IlluminaHiSeqv4试剂盒准备测序文库。从多个样本获得的文库根据制造商的说明等摩尔混合并在IlluminaHiSeq2500序列发生器上测序，产生50bp的单端读数。处理的读数使用STAR软件映像至人类基因组GRCh38。根据ENSEMBL序列数据库的说明（Ensembl77，表达资料在转录水平设置为RPKM每百万映射读数每千碱基读数，由CufTlinks软件生成并在外显子水平上设置总读数，由Bedtools软件生成）。外显子读数被归为外显子长度和校准尺寸，以获得RPKM值。[0497]本发明的代表性源基因在NHL、BRCA、GBC、CCC、MEL、OC、OSCAR、SCLC、UBC、UEC中高度过量表达的表达谱如图2F-H所示。进一步代表性基因的表达分数见表5B。[0498]表5B:选定肽源基因的目标范围。[0499]过度表达被定义为相比最高表达该基因的相关正常组织，在肿瘤上的表达超过1.5倍。70%=1¥。如果一种肽能够从多个源基因获得，最少范围的基因则是决定性的。基线包括以下相关正常组织:脂肪组织、肾上腺、动脉、骨髓、脑、软骨、结肠、食管、胆囊、心脏、肾、肝、肺、淋巴结、胰腺、垂体、直肠、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、胸腺、甲状腺、气管、膀胱和静脉。如果获得同一组织类型几个样本的表达数据，则使用各样本的算术平均值进行计算。AML=急性骨髓性白血病，NHL=非霍奇金淋巴瘤，BRCA=乳腺癌，CLL=慢性淋巴细胞白血病，GBC_CCC=胆囊腺癌和胆管癌，MEL=黑素瘤，OC=卵巢癌，OSCAR=食管癌，包括胃-食管交界处癌症，SCLC=小细胞肺癌，UBC=膀胱癌，UTC=子宫癌。[0503]实施例3[0504]MHC-I类提呈肽的体外免疫原性[0505]为了获得关于本发明TUMAP的免疫原性信息，发明人使用体外T细胞扩增分析方法进行了研究，其中该分析方法基于使用装载肽MHC复合物和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞aAPC进行反复刺激。用这种方法，发明人可显示出本发明目前为止47种HLA-A*0201限制TUMP具有免疫原性，这表明这些肽为对抗人⑶8+前体T细胞的T细胞表位表6A和B。[0506]CD8+T细胞体外激活[0507]为了用载有肽-MHC复合物pMHC和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞进行体外刺激，发明人首先从UniversityclinicsMannheim，Germany中获取健康供体CD8微珠MiltenyiBiotec，Bergisch-Gladbach,Germany透过积极选择白细胞清除术后新鲜HLA-A*02产物而分离出⑶8+T细胞。[0508]PBMC和分离出的⑶8+淋巴细胞使用前在T细胞培养基（TCM中培养，培养基包括RPMI-GlutamaxInvitrogen公司，KarIsruhe，德国）并补充10%热灭活人AB血清（PAN-Biotech公司，Aidenbach，德国）、100Uml青霉素100ygml链霉素（Cambrex公司，CoIogne，德国），lmM丙酮酸钠CCPro公司，Oberdorla，德国）和20ygml庆大霉素Cambrex公司）。在此步骤，2·5ngml的IL-7PromoCe11公司，Heidelberg，德国）和10Uml的IL-2NovartisPharma公司，Niirnberg，德国）也加入TCM。对于pMHC抗-⑶28涂层珠的生成、T细胞的刺激和读出，使用每刺激条件四个不同PMHC分子以及每个读出条件8个不同的pMHC分子在高度限定的体外系统中进行。[0509]纯化的共刺激小鼠462抗人0028抗体9.3〇111叫的1.，1987使用制造商Perbio公司，波恩，德国）推荐的N-羟基琥珀酰亚胺生物素进行化学生物素化处理。所用珠为5.6μηι的链霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙稀颗粒BangsLabooratories，伊利诺伊州，美国）。用于阳性和阴性对照刺激物的PMHC分别为A*0201MLA-001从Melan-AMART-Ι中修饰制得的肽ELAGIGILTVSEQIDN0:289和A*0201DDX5-001从DDX5中获得的YLLPAIVHISEQIDN0:290。[0510]800.000珠20^1包裹于含有4112.5叫不同生物素-?101：的96孔板、进行洗涤，随后加入体积为200μ1的600ng生物素抗-CD28。在37°C下，在含5ngmlIL-12PromoCell的200μ1TCM中共培养IxlO6⑶8+T细胞与2xl05的清洗涂层珠3天，从而激活刺激。之后，一半培养基与补充80UmlIL-2的新鲜TCM进行交换，并且培养在37°C下持续4天。这种刺激性周期总共进行3次。对于使用每条件8种不同pMHC分子的pMHC多聚体读出，二维组合编码方法如前述使用Andersenetal.，2012，稍作修饰，涵盖親合至5种不同的焚光染料。最后，用LivedeadnearIR染料（Invitrogen公司，Karlsruhe，德国）、CD8_FITC抗体克隆SKlBD公司，Heidelberg，德国）和焚光pMHC多聚体而执行多聚体分析。对于分析，使用了配有合适激光仪和筛检程序的BDLSRIISORP细胞仪。肽特异性细胞以占总CD8+细胞的百分比形式进行计算。多聚体分析结果使用FlowJo软件TreeStar公司，Oregon，美国）进行评估。特定多聚体+CD8+淋巴细胞的体外填装用与阴性对照刺激组比较而进行检测。如果健康供体中的至少一个可评价的体外刺激孔在体外刺激后发现含有特异性CD8+T细胞株即该孔包含至少1%特定多聚体+CD8+T细胞，并且特定多聚体+的百分比至少为阴性对照刺激中位数的10倍），则检测给定抗原的免疫原性。[0511]胰腺癌肽体外免疫原性[0512]对于受到测试的HLA-I类肽，可透过肽特异性T细胞株的生成证明其体外免疫原性。TUMAP特异性多聚体对本发明的15种肽染色后流式细胞仪检测的典型结果如图3和图6所示，同时也含有相应的阴性对照信息。本发明2种肽的结果汇总于表6A和B。[0513]表6A:本发明中HLAI类肽的体外免疫原性[0514]申请人对本发明的肽所做的体外免疫原性实验的示例性结果。=70%=++++[0515][0516]表6B:本发明中HLAI类肽的体外免疫原性。[0517]申请人对本发明的HLA_A*02限制肽所做的体外免疫原性实验的示例性结果。提示了体外免疫原性实验的结果。阳性孔和供体（其他可评价）的百分比概括为=70%=++++[0520]实施例4[0521]肽的合成[0522]所有的肽透过使用Fmoc策略以标准、广为接受的固相肽合成法合成。每个肽的身份和纯度已使用质谱和RP-HPLC分析法确定。用冻干法三氟乙酸盐获得白色至类白色的肽，纯度为50%。所有的TUMAP优选作为三氟乙酸盐或乙酸盐进行给药，其他盐形式也可以。[0523]实施例5[0524]MHC结合测定[0525]本发明基于T细胞疗法的候选肽进一步测试其MHC结合能力亲和性）。单个肽-MHC复合体透过UV-配体交换产生，其中，紫外线敏感肽经紫外线照射后裂解，与分析的相关肽交换。只有能够有效地结合并稳定肽接受MHC分子的候选肽才能阻止MHC复合物的解离。为了确定交换反应的产率，将基于稳定MHC复合物轻链〇32m的检测结果进行ELISA测定。检测总体上按照Rodenko等人在Rodenkoetal.，2006中描述的方法进行。[0526]96孔Maxisorp板NUNC在室温下在I3BS中以2ugml链霉包被过夜，用4倍洗涤并在37°C下在含封闭缓冲液的2%BSA中封闭1小时。折迭的HLA-A*02:01MLA-OO1单体作为标准品，涵盖15-500ngml的范围。紫外线交换反应的肽-MHC单体在封闭缓冲液中稀释100倍。样本在37°C下孵育1小时，洗涤四次，在37°C下以2ugmlHRP缀合抗-i32m温育1小时，再次洗涤，并以NH2SO4封堵的TMB溶液进行检测。在450nm处测量吸收。在生成和产生抗体或其片段时和或T细胞受体或其片段时，通常优选显示为高交换产率优选为高于50%，最优选为高于75%的候选肽，这是因为它们对MHC分子表现出足够的亲合力，并能防止MHC复合物的解离。[0527]表7:MHC-I类结合分数。[0528]HLA-I类限制肽与HLA-A*02:01的结合根据肽交换产量评估：彡10%=+;彡20%=+；20%—49%=++；%=++；^50%—=+++；^75%=+++；^=75%=++++[0537]实施例6[0538]表8:本发明中的优选肽[0539][0540]细胞表面提呈的肿瘤相关肽的绝对定量[0541]粘合剂例如抗体和或TCR的产生是一个费力的过程，其可以仅针对一些选定靶标进行。在肿瘤相关和特异性肽的情况下，选择标准包括但不限于排除提呈于细胞表面上肽的提呈和浓度。除了本文所述肽的分离和相对定量，发明人也分析了所述每个细胞的绝对肽拷贝数。实体肿瘤样本中每个细胞的TUMP拷贝数定量需要分离TUMAP的绝对定量、TUMAP分离效率和分析的组织样本细胞计数。[0542]NanoLC-MSMS肽定量[0543]对于透过质谱法对肽的准确定量，使用内标法生成每种肽的校准曲线。内标是每种肽的双同位素标记的变体，即，TUMP合成中纳入2个同位素标记的氨基酸。它与肿瘤相关肽仅在质量上不同，但在其他的物理化学性质方面无差异Andersonetal.，2012。内标被掺人到每个MS样本，所有MS信号均标准化为内标MS信号，以平衡MS实验之间潜在的技术差异。[0544]校准曲线用至少三种不同的矩阵绘制，S卩，来自于类似于常规MS样本的天然样本的HLA肽洗脱液，并且每个制备品以重复MS运行进行测量。对于评价，MS信号被标准化为内标信号，校准曲线透过logistic回归计算。[0545]对于来自组织样本的肿瘤相关肽的定量，各样本也掺有内标;MS信号标准化为内标并使用该肽校正曲线进行定量。[0546]肽MHC分离的效率[0547]对于任何蛋白质纯化过程，来自组织样本蛋白的分离与相关蛋白的一定损失相关联。为了确定TUMP分离的效率，针对选定为绝对定量的所有TUMP产生了肽MHC复合体。为了能够天然肽MHC复合体与加样物，使用了单同位素标记版本的TUMAP，即TUMAP合成期间纳入1个同位素标记的氨基酸。这些复合物被掺入新制备的组织裂解物中，例如，在TUMP分离过程中最早可能时间点，然后在之后的亲和纯化中像天然肽MHC复合物被获取。因此，测量单标记TUMP的恢复可得到个体TUMP分离效率相关的结论。[0548]分离效率使用少量样本进行分析，且这些组织样本可比较。与此相反，个体肽之间的分离效率不同。这表明，分离效率虽然只在有限数量的样本中进行测定，但可外推至任何其他组织制备品中。但是，由于分离效率不能从一种肽外推至其他肽，因此，有必要单独分析每个TUMAP。[0549]固体、冷冻组织中细胞计数的测定[0550]为了确定经过绝对肽定量的组织样本的细胞数，发明人采用了DNA含量分析。此方法适用于不同来源的广泛样本，且最重要的是，冷冻样本Alcoseretal.，2011;ForseyandChaudhuri，2009;Silvaetal.，2013。在肽分离方案期间，组织样本被加工为均勾的裂解物，从中取一小等份裂解物。样本等分为三份，从中分离DNAQiaAmpDNAMiniKit，Qiagen，Hilden，德国）。每次DNA分离的总DNA含量至少重复两次使用基于荧光的DNA定量测定法（QubitdsDNAHSAssayKit，LifeTechnologies，Darmstadt，德国）进行定量。[0551]为了计算细胞数，生成了来自单个健康血细胞等分试样的DNA标准曲线，使用一系列指定的细胞数。标准曲线用于计算每次DNA分离总DNA含量的总细胞含量。用于肽分离的组织样本的平均总细胞计数，在考虑裂解物等份的已知体积和总裂解物体积的情况下进行推算。[0552]每个细胞的肽拷贝数[0553]使用前述实验的数据，发明人以总肽量除以样本总细胞计数计算得出每个细胞的TUMP拷贝数，随后除以分离效率。选定肽的细胞拷贝数如表9所示。[0554]表9:绝对拷贝数。该表列出了肿瘤样本中绝对肽定量的结果。针对每种肽，每个细胞的中位拷贝数表示：=100=++;=1，〇〇〇+++;=10，〇〇〇=++++。提示样本数量，其中提供评估的高质量MS数据。[0557]参考文献列表[0558]AdelaideJ.etal.,CancerRes672007:11565-11575[0559]Alcoser,S.Y.etal.,BMC.Biotechno1.112011：124[0560]AllisonJ.P.etal.,Science2701995:93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权利要求：1.一种肽，其包括选自SEQIDNo.1至SEQIDNo.288组成群组的一个氨基酸序列、以及与SEQIDNo.1至SEQIDNo.288具有至少88%同源性的其变体序列、且其中所述变体与主要组织兼容性复合体MHC结合和或诱导与该变体肽发生T细胞交叉反应；以及其一种药用盐，其中所述肽不是一种全长多肽。2.根据权利要求1中所述的肽，其中所述肽有能力与MHC-I或-II类分子结合，其中所述肽与MHC结合时能够被CD4和或CD8T细胞识别。3.根据权利要求1或2中所述的肽或其变体，其中氨基酸序列包括SEQIDNo.1至SEQIDNo.288任何一个序列中的一个连续的氨基酸延伸区。4.根据权利要求1至3任一项中所述的肽或其变体，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸、更优选为8至16个氨基酸、最优选为该肽该肽系由或基本系由根据SEQIDNo.1至SEQIDNo.288任何的氨基酸序列组成。5.根据权利要求1至4任一项中所述的肽或其变体，其中所述肽被修饰和或包含非肽键。6.根据权利要求1至5任一项所述的肽或其变体，其中所述肽为融合蛋白的一部分，尤其包含HLA-DR抗原相关不变链Ii的N-端氨基酸。7.根据权利要求1至6任一项中所述的一种编码肽或其变体的核酸，任选连接到一个异源启动子序列。8.根据权利要求7中所述的一种表达核酸的表达载体。9.一种重组宿主细胞，其包括根据权利要求1至6中所述的肽、根据权利要求7中所述的核酸、根据权利要求8中所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选为抗原提成细胞，例如树突状细胞。10.根据权利要求1至6任一项中所述的肽或其变体、根据权利要求7中所述的核酸、根据权利要求8中所述或根据权利要求9中所述的药用表达载体。11.一种制备根据权利要求1至6任一项所述的肽或其变体的方法，该方法包括培养根据权利要求9所述的宿主细胞、其提呈所述根据权利要求1至6所述的肽或表达根据权利要求7所述的核酸或包括根据权利要求8所述的表达载体，以及从所述宿主细胞或其培养基中分离出所述肽或其变体。12.—种体外制备激活的T淋巴细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面或人工模拟的抗原提呈细胞结构表面上表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式激活T细胞，其中所述抗原为权利要求1至4任一项中所述的肽。13.根据权利要求12中所述的方法制成的激活T淋巴细胞，其有选择性地识别一种细胞，该细胞提呈含权利要求1至4任一项中给定氨基酸序列的多肽。14.一种杀灭患者中靶向细胞的方法，其中靶向细胞提呈一种多肽，该多肽含权利要求1至4任一项中给定的氨基酸序列；一种给药方法，其中包括给予患者根据权利要求13中定义的有效量T细胞。15.—种抗体，特别是可溶性或膜结合性抗体，其特异性地识别根据权利要求1至5中的肽或其变体，与MHC分子结合时优选为根据权利要求1至5中任一项所述的肽或变体。16.根据权利要求1至6任一项中所述的一种肽、根据权利要求7中所述的核酸、根据权利要求8中所述的一种表达载体、根据权利要求9中所述的细胞或根据权利要求13中所述的激活毒性T淋巴细胞或根据权利要求15中所述的抗体用于诊断和或治疗癌症或用于制造抗癌药剂。17.根据权利要求1至6任一项中所述的肽、根据权利要求7中所述的核酸、根据权利要求8中所述的一种表达载体、根据权利要求9中所述的细胞、根据权利要求13中所述的活化的T淋巴细胞或根据权利要求15中所述的抗体对于根据权利要求16的用途，其中所述癌症选自肝细胞癌HCC、结直肠癌CRC、胶质母细胞瘤GB、胃癌GC、食道癌、非小细胞肺癌NSCLC、胰腺癌（PC、肾细胞癌（RCC、良性前列腺增生（BPH、前列腺癌（PCA、卵巢癌OC、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病（CLL、梅克尔细胞癌MCC、小细胞肺癌SCLC、非霍奇金淋巴瘤NHL、急性骨髓性白血病AML、胆囊癌和胆管癌GBCXCC、膀胱癌UBC、子宫癌UEC和其他肿瘤，这些肿瘤过度表达来自根据任意SEQIDNo.1至SEQIDNo.288的肽所衍生的蛋白。18.—种药盒，包括：a—个容器包含一种药物组合物，其含有根据权利要求1至6任一项所述的肽或变体、根据权利要求7所述的核酸、根据权利要求8所述的表达载体、根据权利要求10所述的细胞、根据权利要求13所述的激活T淋巴细胞或根据权利要求15所述的溶液或冻干形式的抗体；⑹可选地，第二个容器，其含有冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；c可选地，至少一种以上肽，选自由SEQIDNo.1至SEQIDNo.288基团，以及d可选地，（i使用溶液或（ii重组和或使用冻干粉剂型的说明书。19.根据权利要求18所述的套件，进一步包括一个或多个（iii缓冲剂，（iv稀释剂，V过滤液，（vi针，或V注射器。20.根据权利要求18或19所述的套件，其中所述肽系选自SEQIDNo.1至SEQIDNo.288组成的基团。21.—种用于生产个性化抗癌疫苗用于个体患者，所述方法包括：a识别所述个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽TUMP;b将a中确定的肽与已经接受过免疫原性预筛查和或与正常组织相比在肿瘤中过度提呈的存储库的肽进行比较。c选择与患者中识别的TUMP匹配的存储库中的至少一种肽;和d制备基于步骤c中的个性化疫苗。22.根据权利要求21中所述的方法，其中所述TUMP透过以下方法识别：al将肿瘤样本的表达数据与肿瘤样本组织类型相应的正常组织样本的表达数据进行比较，以识别在肿瘤样本中过度表达或异常表达的蛋白；和a2将表达数据与肿瘤样本中MHCI类和或II类分子结合的MHC配体序列相关联，以识别肿瘤过度表达或异常的蛋白质衍生的MHC配体。23.根据权利要求21或22所述的方法，其中MHC配体的序列的确定方法是:洗脱来自肿瘤样本分离的MHC分子结合肽，并测序洗脱配体。24.根据权利要求21至23任一项所述的方法，其中该类型肿瘤样本相应的正常组织样本获得自同一患者。25.根据权利要求21至24任一项中所述的方法，其中存储库包含的肽用基于以下步骤进行识别：aa.透过高度并行的方法，例如微数组或基于测序的表达谱，进行全基因组信使核糖核酸mRNA表达分析，其包括识别相较于正常组织在恶性组织中过度表达的基因；ab.选择步骤aa检测到的特异性表达或过度表达的基因所编码的肽，以及ac.透过选定的肽确定诱导体内T细胞反应，包括使用健康供体或所述患者的人类T细胞的体外免疫原性测定;或ba.用质谱法识别来自所述肿瘤样本的HLA配体；bb.透过高度并行的方法，例如微数组或基于测序的表达谱，进行全基因组信使核糖核酸mRNA表达分析，其包括识别相较于正常组织在恶性组织中过度表达的基因；be.比较识别的HLA配体与所述基因表达资料；bd.选择步骤be检测到的特异性表达或过度表达的基因所编码的肽；be.重新检测肿瘤组织上来自步骤bd的选定TUMAP、其在健康组织上缺乏或不经常检测，并确定在mRNA水平上过度表达的相关性;以及bf.透过选定的肽确定诱导体内T细胞反应，包括使用健康供体或所述患者的人类T细胞的体外免疫原性测定。26.根据权利要求21至25任一项所述的方法，其中存储库是否包括肽免疫原性由含有体外免疫原性实验、个体HLA结合性患者免疫监测、MHC多聚体染色、ELISPOT分析和或细胞内细胞因子染色的一种方法确定。27.根据权利要求21至26任一项所述的方法，其中所述存储库包括选自SEQIDNo.1至SEQIDNo.288组成的基团的多个肽。28.根据权利要求21至27任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤:识别与该个体患者相应正常组织相比对所述肿瘤样本具有唯一性的至少一种突变，以及选择与突变相关并包含于疫苗或用于产生细胞疗法的一种肽。29.根据权利要求28中所述的方法，其中所述至少一种突变透过全基因组测序鉴定。30.—种T细胞受体，优选为一种重组可溶性或膜结合T细胞受体，其中所述配体由与选自SEQIDNo.1至SEQIDNo.288组成的组的氨基酸序列至少75%同源性。31.根据权利要求30所述的T细胞受体，其中所述氨基酸序列与SEQIDNo.1至SEQIDNo.288至少88%同源。32.根据权利要求30或31所述的T细胞受体，其中所述氨基酸序列包含SEQIDNo.1至SEQIDNo.288中的任何一个。33.根据权利要求30至32中任何一项所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体作为可溶性分子提供并任选具有进一步的效应子功能，如免疫刺激域或毒素。34.根据权利要求30至33任一项中所述的一种编码TCR的核酸，任选连接到一个异源启动子序列。35.根据权利要求34中所述的一种能表达核酸的表达载体。36.—种重组宿主细胞，其包括根据权利要求34中所述的核酸或编码根据权利要求15中所述的一种抗体或根据权利要求35所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选为T细胞或NK细胞。37.根据权利要求30至33任一项中所述的一种制备T细胞受体的方法，所述方法包括根据权利要求36中所述的培养宿主细胞，以及从宿主细胞和或其培养基中分离出所述T细胞受体。38.—种适体，其特异性地识别根据权利要求1至5中的肽或其变体，优选为根据权利要求1至5中任一项所述的、与MHC分子结合的肽或变体。39.—种药物组合物，其包括至少一种活性成分，该成分选自根据权利要求1至6任一项中所述的肽、根据权利要求7中所述的核酸、根据权利要求8中所述的一种表达载体、根据权利要求9中所述的细胞、根据权利要求13中所述的激活T淋巴细胞或根据权利要求15中所述的抗体或根据权利要求30-32任一项中所述的T细胞受体或根据根据权利要求38中所述的适体以及一种药用载体和药用赋形剂和或稳定剂。

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