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申请/专利权人：中国热带农业科学院橡胶研究所

摘要：本发明提供了一种获得橡胶树纯合基因编辑植株的方法，涉及基因工程技术领域。将基因编辑载体进行酶切，得到酶切载体，与靶标序列连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌中和农杆菌中，得到转化菌，侵染橡胶树体胚等步骤得到橡胶树纯合基因编辑植株。本发明以基因编辑载体作为转化供体，通过对阳性抗性体胚的高通量测序判断其是否为嵌合体，T0代抗性体胚均为嵌合体。本发明通过对获得的T0代阳性嵌合体胚进行切胚纯化后继续继代，从而获得了T1代抗性体胚，T1代抗性体胚有约50％的比例达到了纯合，挑选这些T1代纯合编辑体胚进行植株再生，本发明首次获得了橡胶树纯合基因编辑植株。

主权项：1.一种获得橡胶树纯合基因编辑植株的方法，其特征在于，步骤为：1将pCAMBIA1300-2×35SCas9-HbU6.2载体进行酶切，得到酶切载体；所述pCAMBIA1300-2×35SCas9-HbU6.2载体的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；2将所述步骤1得到的酶切载体与靶标序列连接，得到连接产物；3将所述步骤2得到的连接产物转化到大肠杆菌中，提取质粒，将所述质粒转入到农杆菌中，得到转化菌；4将所述步骤3得到的转化菌侵染橡胶树体胚，得到侵染体胚；5将所述步骤4得到的侵染体胚切胚，得到胚块，将所述胚块进行愈伤组织诱导培养和体胚形成培养，筛选阳性转化体胚得到T0代体胚；6将所述步骤5得到的T0代体胚切胚，得到胚块，将所述胚块进行愈伤组织诱导培养和体胚形成培养，得到T1代体胚，挑选纯合基因编辑体胚进行植株再生，得到橡胶树纯合基因编辑植株；所述步骤2靶标序列由引物对退火得到，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述基因为HbPDS基因，所述靶标位于第12个外显子上，序列如SEQIDNo.5所示；所述步骤5和6胚块的大小都为2～3mm×2～3mm；所述步骤5使用特异引物对筛选阳性转化体胚；所述特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述特异引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；以体胚形成培养得到体胚的基因组DNA为模板，经所述特异引物对进行PCR扩增，当扩增出433bp条带时，所述体胚为阳性转化体胚；所述步骤2连接的体系为：酶切载体50ng、10×T4ligasebuffer1μL、靶标序列7μL、T4连接酶0.5μL，ddH2O补足至10μL；所述连接的条件为：在20～30℃下连接1h；所述步骤1酶切的体系为：10×AarIbuffer5μL、50×oligonucleotide1μL、AarI酶1μL、pCAMBIA1300-2×35SCas9-HbU6.2载体1μg，ddH2O补足至50μL；所述酶切的条件包括：在37℃下酶切5h；所述步骤3农杆菌为农杆菌EHA105；所述步骤4侵染的条件为：在含有转化菌的菌液中添加乙酰丁香酮后，将橡胶树体胚置于菌液中静止孵育8min，超声处理后，再静止孵育10min；所述超声处理的条件为：在40kHz下处理50s；所述步骤5和6愈伤组织诱导培养的条件都为：在含有3.0mM氯化钙、7.0μMKT、8.1μM萘乙酸、6.8μM2,4-D、204.5mM蔗糖、2.2gL植酸酶、10mgL潮霉素和500mgLtimentin的MS愈伤组织诱导培养基上暗培养30d，所述暗培养的温度为24℃；所述步骤5和6体胚形成培养的条件都为：将萌发的愈伤组织转移到含有10mgL潮霉素的体胚形成培养基中培养2个月。

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