买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

摘要：本发明公开了一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，该方法通过树鼩大脑皮层的分离、树鼩脑微血管段的富集、树鼩脑微血管段的消化分离、树鼩脑微血管内皮细胞的培养、树鼩脑微血管内皮细胞的初步纯化培养、树鼩脑微血管内皮细胞的嘌呤霉素纯化培养、可连续传代树鼩脑微血管内皮细胞的筛选等步骤获得可连续传代120代以上的树鼩脑微血管内皮细胞，且细胞保持稳定的细胞活力和均一的细胞形态，本发明方法没有端粒酶或者SV40等外源基因的引入，避免了转化细胞引起特性改变或者恶化的风险，为体外研究脑微血管内皮细胞相关疾病提供了理想的实验材料。

主权项：1.一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于，步骤如下：（1）从新生树鼩脑部分离获得大脑皮层，用4℃含1%双抗的D-Hanks液反复冲洗3-5次后剪碎，在粉碎的大脑皮层中加入消化液，37℃孵育消化40-60min，每隔20min颠倒混匀一次；消化产物经200目细胞网筛过滤，收集滤网上组织碎块，用含1%双抗的D-Hanks液重悬，离心弃上清；沉淀用含20-25%BSA的DMEMF-12培养液重悬，4℃下离心，弃上清，得到富集的微血管段；（2）在富集的微血管段中加入混合消化液进行二次消化，于37℃中消化25-35min，每隔10min颠倒混匀一次，离心后弃上清液，沉淀用含10-20%FBS的DMEMF-12培养液重悬，离心弃上清，重复此步骤一次；（3）将步骤（2）中微血管段消化后所得的组织细胞沉淀，用完全培养基重悬混匀，接种在细胞培养瓶中，培养24h后弃旧液，用含1%双抗的PBS冲洗以去除未贴壁细胞和组织碎块，补充新鲜的完全培养基，之后每3天换液一次，连续培养6-9天；观察细胞生长情况，待细胞贴壁面积达60-80%，使用含EDTA的0.25%胰酶进行首次消化传代；（4）树鼩脑原代微血管内皮细胞经过2次传代后，开始进行“差速消化+差速贴壁”纯化培养，即加入含EDTA的0.25%胰酶消化1-2min，即刻加入完全培养基终止消化，并按照1:2传代；细胞贴壁0.5-1h后，吸去培养液以去除未贴壁细胞，补充新鲜的完全培养基，继续培养2-3d至细胞贴满瓶底80%以上；重复“差速消化+差速贴壁”纯化培养一次，即得到初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞；（5）对初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞进行消化传代，当细胞铺满瓶底70-80%时，用含5ngmL嘌呤霉素的完全培养基作用10-12h，之后去除培养液，使用PBS漂洗两次；补充完全培养基继续培养2-3天，至细胞铺满瓶底70-80%，按照1:2进行消化传代，重复嘌呤霉素纯化培养1次，即得到更高纯度的树鼩脑微血管内皮细胞；（6）将步骤（5）所得纯化的树鼩脑微血管内皮细胞按照1:5进行消化传代，使用不含内皮细胞生长因子的完全培养基持续培养6-8天，每3天换液一次，至细胞铺满瓶底60%-80%，进行消化并按照1:2进行传代，使用不含内皮细胞生长因子的完全培养基，即得到可连续传代的树鼩脑微血管内皮细胞；步骤（1）中的消化液是含60UmLDNaseⅠ、2mgmLⅡ型胶原酶、不含EDTA的0.05%胰酶的PBS溶液；步骤（2）混合消化液是2mgmL的Ⅱ型胶原酶、2mgmL的分散酶、60UmL的DNaseI按体积比1:1:1的比例混合制得。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国医学科学院医学生物学研究所 一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法