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摘要：本发明公开了一种增强α‑突触核蛋白聚集体稳定性的方法，利用胰蛋白酶Trypsin和蛋白酶KPK消化实验比较分析磷酸盐缓冲液Phosphatebuffersolution，PBS、健康对照Healthycontrol，HC人群血浆及PD患者血浆孵育形成的α‑Syn聚集体的稳定性差异，为探讨不同条件孵育形成的α‑Syn聚集体的不同神经毒性差异提供实验依据。
主权项：1.一种增强α-突触核蛋白聚集体稳定性的方法，其特征在于：包括如下步骤：1α-突触核蛋白聚集体的制备：用140μL0.01MPBS将1mg重组人α-突触核蛋白溶解，添加70μLPD血浆，得到PD组，使α-突触核蛋白终浓度为5mgmL，添加防腐剂抑制细菌生长，在37℃恒温振荡混匀仪中以1000rpm转速振荡孵育7天；用BCA法测定孵育后蛋白浓度，分装后于-80℃保存备用；2胰蛋白酶消化α-突触核蛋白聚集体：将胰蛋白酶与PD组10μgα-突触核蛋白聚集体以1:80、1:40、1:20比例分别混合，用0.01MPBS补足至终体积20μL，于37℃消化30min后变性，利用Westernblotting法评估胰蛋白酶消化后α-突触核蛋白聚集体的降解情况；3蛋白酶K消化α-突触核蛋白聚集体：分别将1、1.5及2μgmL蛋白酶K与PD组10μgα-突触核蛋白聚集体混合，用0.01MPBS补足至终体积为20μL，于37℃孵育30min后变性，利用WB法评估蛋白酶K消化后α-突触核蛋白聚集体的降解情况；4WB法检测α-突触核蛋白的聚集体的表达差异：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PD组800ngα-突触核蛋白后，将蛋白转移至PVDF膜上；5％脱脂奶粉室温封闭1h；室温孵育抗α-突触核蛋白单克隆抗体2h；室温孵育山羊抗兔荧光二抗1h后使用ODYSSEY双色红外荧光成像系统扫膜成像；5统计学方法：采用ImageJ软件进行图像灰度分析，GraphPadPrism8.0.2软件进行数据统计及分析，计量资料以均数±标准差，表示，组间均数比较采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验，以P0.05为差异有统计学意义。
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