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摘要：本发明涉及β‑胡萝卜素技术领域，且公开了一种强化解脂耶氏酵母生产β‑胡萝卜素的方法，将外源β‑类胡萝卜素合成模块基因利用合成生物学的方法，插入到解脂耶氏酵母po1f基因组中，使其生产β‑胡萝卜素，之后将0.8％C＝1molL双氧水或4.1％C＝1molL乙酸作为氧化物质对产β‑胡萝卜素的解脂耶氏酵母YLBC1细胞造成氧化损伤，通过表达二氨基庚二酸脱羧酶和赖氨酸水解酶基因实现对细胞氧化损伤的缓解，同时实现β‑胡萝卜素的产量显著提升。

主权项：1.一种强化解脂耶氏酵母生产β-胡萝卜素的方法，其特征在于：利用双氧水或乙酸两种物质添加到产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌株YLBC1细胞中造成细胞氧化损伤，然后通过表达以下基因来缓解细胞氧化损伤，同时提升β-胡萝卜素的产量，具体生产方法如下：S1、构建pCRI-C4、pCRI-A1载体以pCRISPRylNat载体为模板，构建用于基因敲入的含相应位点sgRNA的pCRI-A1质粒，通过NsiⅠ和AatⅡ两种限制性内切酶将pCRISPRylNat质粒通过双酶切获得骨架V-pCRI，之后以pCRISPRyl载体为模板设计的引物A1N20-FA1N20-R与以pCRISPRyl载体为模板设计的引物pCRI-V-FpCRI-V-R进行PCR，将原始N20序列替换成A1位点的相应N20序列，利用GibsonAssembly的方法，将扩增出的含N20DNA片段和载体骨架片段V-pCRI根据检测出的浓度按照比例混合，再加入无缝连接组装技术的酶试剂，50℃水浴孵育30分钟后，热激法转化E.coliDH5α并验证，构建成为pCRI-A1载体，载体pCRI-C4也用上述方法构建；S2、构建同源供体线性片段构建LH-pGAP-DapDC-tCYC1-php4d-LHs-tXPR2-LEU2-RHA1供体片段用于在解脂耶氏酵母中过表达二氨基庚二酸脱羧酶和赖氨酸水解酶基因，其中左右同源臂LH、RH为A1sgRNA序列的上游和下游1000bp，使用以解脂耶氏酵母Yarrowialipolyticapo1f基因组为模板设计的两对引物A1-LH-FA1-LH-R和以解脂耶氏酵母Yarrowialipolyticapo1f基因组为模板设计的引物A1-RH-FA1-RH-R，对po1f基因组进行扩增，利用以pPT载体为模板设计的引物pGAP-FpGAP-R、以pPT载体为模板设计的引物tCYC1-FtCYC1-R、以pPT载体为模板设计的引物php4d-Fphp4d-R、以pPT载体为模板设计的引物tXPR2-FtXPR2-R，将供体片段所需的启动子与终止子从含有这些基因的合成质粒pPT中通过PCR进行扩增，利用以野生型解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica基因组为模板设计的引物LEU2-FLEU2-R增LEU2基因，以含有DapDC、LHs基因的合成pUC57-DL载体为模板设计的引物DapDC-FDapDC-R与以pUC57-DL载体为模板设计的引物LHs-FLHs-R，扩增DapDC和LHs基因，并利用overlap连接将上述基因片段按顺序连接成完整的线性同源供体片段，同理，用于生产β-胡萝卜素的LH-pTEF-carB-tTEF-pTEFin-carRP-tADH1-URA3-RHC4供体片段也按照上述方法进行构建；S3、基因敲入首先制备酵母感受态，将解脂耶氏酵母细胞在10mlYPD中30℃培养至中期，取菌液5000×g离心4分钟，弃上清后加入10毫升Frozen-EZ酵母溶液1进行重悬，再次离心后去上清，加入1mlFrozen-EZ酵母溶液2吹吸重悬，分装到离心管后放至-80℃冷冻保存；然后将构建好的质粒和供体片段进行转化，将50μl感受态细胞与1μgDNA混合，加入500μlFrozen-EZ酵母溶液3充分混合后30℃金属浴45分钟，在温浴过程中用手指轻弹2-3次混合，将上述转化液涂抹50μl在相应的筛选平板上，在30℃下培养2-4天进行培养，之后挑取单菌落进行菌落PCR验证，模板的制备过程采取快速冻融法，从转化平板上挑取适当菌量重悬于20μl0.08％NaOH溶液，于95℃裂解10分钟，迅速转移到液氮中处理2-3分钟，重复该步骤3次，离心后取1μl上清液作为模板进行菌落PCR鉴定后回收测序；S4、摇瓶发酵将验证敲入成功的单克隆菌液接种至5mLYPD培养基，置于30℃，250rpm培养过夜至OD600值为3～5，在20mlYPD发酵培养基中添加0.8％C＝1molL双氧水或4.1％C＝1molL乙酸作为氧化物质，吸取2OD600的菌量至培养基中使得培养基中菌体的终OD600为0.2，置于20℃，250rpm培养3-5天；S5、β-胡萝卜素产物提取与检测吸取适量菌液进行高效液相色谱检测胞内β-胡萝卜素含量，取50μl发酵液于1.5mlEp管中，12000rpm离心3min，弃上清，加入500μLDMSO吹打混匀,旋涡振荡30s，65℃避光保存10min，之后加入500μL丙酮，旋涡振荡30s,65℃避光保存15min，12000rpm离心3min，此时菌体应该为白色取上清过滤0.22um滤膜，进行HPLC检测，配备C18柱4.6mm×250mm，在474nm进行UVVIS检测，流动相由乙腈-甲醇-异丙醇5：3：2vv组成，流速为40℃，流量为1mLmin，根据β-胡萝卜素标品构建的标准曲线，检测获得的β-胡萝卜素产物产量。

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