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申请/专利权人：朱运峰

申请日：2021-11-05

公开（公告）日：2024-12-20

公开（公告）号：CN119162319A

专利技术分类：....· · · 用于癌症 (癌症的免疫监测入 G01N 33/574 )[2018.01]

专利摘要：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种评估靶基因DNA甲基化程度的方法和应用，本发明首先利用PCR技术，通过碱基掺入制备不同程度的甲基化DNA片段，进行定量PCR检测，建立△Ct与DNA甲基化程度之间的对应关系，并绘制曲线，通过检测样本中靶基因△Ct值，实现对该基因甲基化程度的评估。本发明为检测DNA甲基化差异建立了新的更加便捷的方法，可对靶基因片段在不同样本中的甲基化程度进行鉴定，或基于靶基因在不同群体之间甲基化程度的差异，评判群体之间的差异。经肺癌与结直肠癌血液样本实验验证，所述方法操作简便、检测时间短，并且结果准确可靠，适用于所有类型的甲基化DNA片段的检测，具有极高的应用价值。

专利权项：1.一种评估靶基因DNA甲基化程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：1利用Taq酶预混液体系、靶基因定量PCR检测的引物和探针配制定量PCR检测的反应体系，对靶基因分别进行较高温变性扩增和较低温变性扩增，得到较高温变性扩增的CtX-HT和较低温变性扩增的CtX-LH；2将步骤1所述CtX-LH和所述CtX-HT带入公式I中，得到靶基因的△Ctx；△Ctx＝CtX-LH–CtX-HT公式I其中，△Ctx表示X基因的检测值；CtX-LH表示X基因在较低温变性条件下扩增的Ct值；CtX-HT表示X基因在较高温变性条件下扩增的Ct值，X基因表示一种靶基因；3利用PCR技术和用于绘制参考曲线的试剂，通过碱基掺入制备不同程度的甲基化DNA片段，稀释后作为PCR扩增的甲基化DNA模板，按照步骤1和步骤2的方法操作，获得不同甲基化DNA片段的△Ctx'，得到不同比例甲基化胞嘧啶与ΔCtx'之间的线性关系，绘制参考曲线；4将步骤2中靶基因的ΔCtx与步骤3中参考曲线中ΔCtx'进行比较，得到靶基因中实际甲基化胞嘧啶的比例，从而判断靶基因的DNA甲基化程度；所述较高温变性扩增的反应条件如下：95℃5min；94℃5s，60～62℃15s，72℃30s，45个循环；所述较低温变性扩增的反应条件如下：85～88℃15s，60～62℃15s，72℃30s，18个循环；94℃5s，60～62℃15s，72℃30s，27个循环；所述用于绘制参考曲线的试剂包括含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP试剂；所述含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP试剂包括等摩尔浓度的dATP、dTTP、dGTP和试剂A；所述试剂A为5'-m-dCTP和或dCTP。

百度查询： 朱运峰 一种评估靶基因DNA甲基化程度的方法和应用