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申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明属于生物学领域，具体涉及一种特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEB1基因和蛋白表达水平的siRNA及方法。所述的siRNA的序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。所述的特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEB1基因和蛋白表达水平的方法，是将SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示序列与转染试剂混合加入山羊卵泡颗粒细胞培养液中培养卵泡颗粒细胞，降低CPEB1基因和蛋白表达水平。采用本发明的方法，可以特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEB1基因和蛋白表达水平。

主权项：一种特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEB1基因和蛋白表达水平的siRNA，其特征在于，其序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。

全文数据：一种特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEB1基因和蛋白表达水平的siRNA及方法技术领域[0001]本发明属于生物学领域，具体涉及一种CPEBl基因和CPEBl蛋白在卵泡颗粒细胞中的敲低的方法。背景技术[0002]胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白（CPEBs是一组高度保守的RNA结合蛋白，其作用机制是通过与mRNA3’UTR的特定序列CPEBs元件的结合来促进mRNA胞质多聚腺苷酸化诱导的翻译过程，从而使这类mRNA的翻译表达具有时间特异性和空间特异性。CPEBs最早在非洲爪檐卵母细胞的减数分裂研究过程中被发现，它被认为可调控减数分裂期转录沉默的非洲爪赡卵母细胞生长发育中母源性mRNA的多聚腺苷化和翻译过程。随后的研究发现，CPEBs在细胞的生长发育、细胞的周期调节、细胞衰亡、肿瘤发生和发展、记忆突触可塑性等方面起着重要的作用。在对脊椎动物体研究中，研究人员发现了CPEBs蛋白家族中的四个家族成员CPEBl〜4,而CPEBl是该家族中关系较远的成员并和CPEB2〜4属于不同的蛋白，它们虽然有相同的RNA结合基序元件，但有不同的调控区域和各自独特的生物学功能及表现型。[0003]目前的硏究结果己经证实，CPEBl能够通过调节POlyA尾的长度来激活或抑制mRNA的翻译。PolyA尾长度的暂时调控能够弥补细胞分裂过程中转录的缺失，同时是调控细胞有丝分裂的一种常规机制。有丝分裂时期细胞的增殖需要CPEBl的参与。同时，CPEBl通过参与纺锤体和联会复合体的形成来调控细胞减数分裂，CPEBl对纺锤体和联会复合体的形成有着促进作用。从卵母细胞发生过程来看，排卵前卵母细胞中的CPEBl基因发生过表达并导致细胞周期蛋白CYCLINB表达量增加。而CYCLINB与⑶K结合形成MPF，推进细胞由G2期进入M期，减数分裂过程中CYCLINB的表达水平越高，其对细胞的增殖促进能力就越强。所以认为，CPEBl参与细胞周期蛋白CYCLINB的合成过程，并且是通过上调CYCLINB表达水平以及加速纺锤体的形成的途径在减数分裂过程中发挥作用，并促进卵母细胞的生长发育。[0004]RNA干扰RNAinterference，RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活性及基因表达的监控机制，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNAdouble-strandedRNA，dsRNA，在细胞内特异地降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的过程。由于这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS。研究中导入的双链RNA多为21_23nt的小分子干扰RNA片段（smallinter-feringRNAs，简称siRNAs，又称引导RNAs，引起的RNAi效应较强。[0005]由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，它正在基因表达调控和基因功能研究中发挥重要作用。目前，RNAi已发展成为一种广泛的、用于产生遗传敲除的技术，并且用于通过反向遗传学研究基因功能。RNAi技术作为一个强有力的反向遗传学工具，不仅提供了高效、特异性的抑制基因表达的手段，而且正成为基因功能研究、抗病毒感染研究和基因治疗研究的重要技术方法。[0006]本研究则是利用合成特异的siRNA，以特异性降低山羊卵泡颗粒细胞中CPEBl基因及CPEBl蛋白的表达水平。发明内容[0007]本发明的目的是提供一种特异的siRNA，可以特异性降低山羊卵泡颗粒细胞内CPEB1基因和CPEB1蛋白表达水平。[0008]本发明所述的特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEBl基因和CPEBl蛋白表达水平的siRNA，是siCPEBl-3,其序列如SEQIDNo.9-10所示。[0009]本发明提供了一种降低山羊卵泡颗粒细胞内CPEB1基因和CPEBl蛋白表达水平的方法，是将上述特异的siRNA与转染试剂混合加入山羊卵泡颗粒细胞培养液中培养卵泡颗粒细胞;转染48小时后降低CPEBl基因和CPEBl蛋白表达水平。[0010]本发明中所使用的转染试剂为深圳欣博盛生物科技有限公司的FuGENEkHDTransfectionReagent。其他转染试剂也能达到同样的效果，像Invitrogen公司的Lipofectamine2000,和BBI的LipoHigh脂质体高效转染试剂，都有比较好的转染效果。[0011]实验表明，本发明特异的siRNAsiCPEB1-3干扰活性达到80%以上，效果最优。瞬转siCPEBl-3siCPEBl-NC载体48h后收集颗粒细胞，以qRT-PCR检测CPEBl基因mRNA表达变化，以WesternBlot检测CPEBl基因蛋白的表达变化，荧光定量结果如图3所示，WesternBlot结果如图4和表3所示。从结果中可见，无论在成年母羊还是幼龄母羊中，转染siCPEBl-3载体的卵泡颗粒细胞抑制了CPEBlmRNA和CPEBl蛋白的表达，且显著低于转染siCPEBl-NC的阴性对照组和不转染载体的空白组低。[0012]采用本发明的方法，可以特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEB1基因和CPEB1蛋白表达水平。附图说明[0013]图1:总RNA提取结果。[0014]图2:目的基因CPEBl基因干扰效率检测。[0015]图3:CPEB1基因在干扰组中的相对表达量。[0016]图4:敲低CPEBl对相关蛋白的表达的影响。具体实施方式[0017]1.特征性材料:根据NCBI中山羊CPEBlmRNA全序列GeneID:102176273，应用NCBI中的Primer-BLAST在线设计引物，扩增片段包括全部编码区，引物由生工生物工程上海）股份有限公司合成，引物序列如表1:[0018]表1[0019][0020]2.山羊颗粒细胞总RNA的提取和检测=Trizol法提取山羊颗粒细胞总RNA，并检测提取质量和浓度，OD值在1.8〜2.0之间，使用1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性及污染情况检测，三条带28s，18s和5s都清晰可见，而且28s亮度是18s的两倍，说明了总RNA的质量可靠，可用于后续的实验。电泳检测结果见图1。[0021]3.山羊颗粒细胞CDNA文库的建立：以山羊颗粒细胞总RNA为模板，按照TIANGEN公司FastQuantcDNA试剂盒的说明书操作。[0022]4.CPEB1基因CDS扩增及回收：以反转录后获得的cDNA为模板，按照Vazyme公司提供的说明书进行CPEBl基因CDS的PCR扩增，PCR扩增产物以1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，使用DNA回收试剂盒纯化回收PCR扩增产物。[0023]5.CPEB1基因siRNA的构建:本实验中CPEB1基因的siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，共合成3对靶序列SiRNA，和一个阴性对照，具体设计靶位点如表2:[0024]表2[0027]6.CPEBl基因siRNA干扰活性的验证:先分离培养山羊卵泡颗粒细胞，当细胞密度达到60%左右时按照FuGENiFlIDTransfectionReagent使用说明书进行转染，siRNA与FuGENE转染试剂按照4:1比例转染。按照如下过程进行：[0028]IA稀释Fungene转染试剂：用50μ1OpU-MEMiM稀释，轻轻摇晃并在室温下静止5min〇[0029]2B稀释siRNA:用50μ1不含血清培养ϋρϋ-ΜΕΜ®Ι稀释，轻轻摇晃并在室温下静止5min〇[0030]3将上述的A和B轻轻晃均匀，室温下静止10分钟。[0031]4将SiRNA-FuGENE混合液添加到含有山羊卵泡颗粒细胞及不含血清培养OfUi-MEMkI中，37°C的含有5%⑶2培养箱中培养4h，然后更换完全培养液，培养48h，收集细胞待用。[0032]收集的细胞提取总RNA，反转录为cDNA，以实时荧光定量PCR检测各组中目的基因CPEBl的表达变化。[0033]结果显示:在成年羊和幼龄羊中，siCPEBl-NC和空白组之间CPEBl基因表达量没有显著性的差异P〇.〇5，在成年羊中，siCPEBl-l、siCPEBl-2和siCPEBl-3组中CPEBl基因表达量相对于空白组降低了54.19%、86.83%和82.55%;在幼龄羊中，siCPEBl-1、siCPEBl-2和siCPEBl-3组中CPEBl基因表达量相对于空白组降低了48.30%、64.48%和86.87%，综合以上结果，siCPEBl-3干扰活性达到80%以上，效果最优。干扰效率检测如图2所示。[0034]瞬转siCPEBl-3siCPEBl-NC载体48h后收集颗粒细胞，以qRT-PCR检测CPEBl基因mRNA表达变化，以WesternBlot检测CPEBl基因蛋白的表达变化，荧光定量结果如图3所示，WesternBlot结果如图4和表3所示。从结果中可见，无论在成年母羊还是幼龄母羊中，转染siCPEBl-3载体的卵泡颗粒细胞抑制了CPEBlmRNA和CPEBl蛋白的表达，且显著低于转染siCPEBl-NC的阴性对照组和不转染载体的空白组低。[0035]表3成年母羊和幼年母羊敲低组中WB条带灰度值[0038]上述结果表明，所构建的方法，可以特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEBl基因和CPEBl蛋白表达水平。

权利要求：1.一种特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEBl基因和蛋白表达水平的SiRNA，其特征在于，其序列如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示。2.—种特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEBl基因和蛋白表达水平的方法，其特征在于，是将SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示序列与转染试剂混合加入山羊卵泡颗粒细胞培养液中培养卵泡颗粒细胞，降低CPEBl基因和蛋白表达水平。

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