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申请/专利权人：江苏发士达生物科技有限公司

摘要：本发明提供了用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第65位、70位和151位突变位点K65R、K70E和Q151M的ARMS引物对和Taqman探针。本发明还提供了上述引物对和探针的应用。本发明与传统测序方法相比，检测灵敏度高、特异性好、检测成本低，为临床艾滋病患者治疗提供了用药指导，实现了艾滋病患者个体化治疗，能够及时反应艾滋病患者用药有效性，改善艾滋病患者的生存质量，具有广泛的应用前景和长远的社会效益。

主权项：用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV‑1病毒RNA的pol基因的第65位、70位和151位突变位点K65R、K70E和Q151M的ARMS引物对和Taqman探针；K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQ1标记5’端和3’端；Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，分别用ROX和BHQ1标记5’端和3’端。

全文数据：用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针及其应用技术领域[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，还涉及上述引物对和探针在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点中的应用。技术背景[0002]世界上流行的艾滋病大多数是由HIV-I引起的。HIV-I基因组包含gag、pol和env三个结构基因和七81：、^¥、116；1^、¥口1'、¥1；1^、¥口116个调节基因，在5’末端和3’末端为长重复序列LTRWol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶，这三个病毒主要蛋白酶用于蛋白前体的成熟、病毒基因组RNA的逆转录和病毒cDNA在宿主基因组DNA上的整合。[0003]目前市场上已流通30余种抗HIV-I药物用于艾滋病的临床治疗。由于HIV-I的逆转录酶在复制过程中没有校正功能又复制迅速，从而使得HIV-I易于进化、遗传多样性广泛，为HIV-I的耐药突变迅速产生提供了先决条件。目前，对应于每种临床使用的HIV-I治疗药物都有其相应的耐药突变的产生。[0004]地达诺新DDI和富马酸替诺福韦酯TDF是目前常用的两种HIV核苷类逆转录酶抑制剂NRTIs，但是由于耐药突变的产生大大降低了这两种药物的有效性。研究已经证明引起DDI和TDF耐药产生的主要耐药突变是pol结构基因的K65R，K70E和Q151M三种突变。[0005]现阶段应用于检测HIV-I耐药突变的方法主要是PCR产物直接测序法。由于该方法检测周期较长，费用昂贵，非封闭操作，难于避免交叉污染，并且由于DNA直接测序存在的灵敏度较低，杂合突变等问题，使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等问题，因此直接测序方法很难适用于临床检测。[0006]随着艾滋病治疗过程中耐药情况的日益加重，临床上迫切需要开发出能够快速、准确、操作简便和避免交叉污染的HIV-I耐药突变检测方法，用于满足临床用药和检测诊断方面的时效性及个体化医疗方面的要求。发明内容[0007]本发明的目标是为解决现有技术检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的方法存在的灵敏度低、特异性差、操作繁琐、检测成本高、花费时间长等问题，本发明提供了一种灵敏度高、特异性好、检测成本低、快速、简单的艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的荧光定量PCR检测试剂盒，还提供了一种检测试剂盒的使用方法。[0008]技术方案:本发明提供了用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第65位、70位和151位突变位点K65R、K70E和Ql5IM的ARMS引物对和Taqman探针；[0009]K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记5’端和3’端；[0010]K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQl标记5’端和3’端；[0011]Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，分别用ROX和BHQl标记5’端和3’端。[0012]本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第65位突变位点K65R的ARMS引物对和Taqman探针；[0013]K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；[00M]ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记5’端和3’端。[0015]本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第70位突变位点K70E的ARMS引物和Taqman探针；[0016]K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；[0017]ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQl标记5’端和3’端。[0018]本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第151位突变位点Q151M的ARMS引物和Taqman探针；[0019]Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列；[0020]ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，分别用ROX和BHQl标记5’端和3’端。[0021]本发明还提供了上述引物对和探针在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点中的应用。[0022]本发明还提供了一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒，包括权利要求上述ARMS引物对和探针。[0023]优选地，所述试剂盒还包括RT-PCR混合液、混合酶液、阳性对照品混合液、阴性对照品混合液;所述RT-PCR混合液包括RT-PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、3对上下游引物及3条探针;所述混合酶液包括M-MLV逆转录酶和TaqDNA聚合酶。[0024]更优选地，所述试剂盒中各组分含量分别为：[0025]RT-PCR混合液875uL;[0026]混合酶液125uL;[0027]阳性质控品45uL;[0028]阳性对照品混合液45uL;[0029]阴性对照品混合液45uL。[0030]更优选地，所述试剂盒中：[0031]所述RT-PCR混合液包括：[0032]RT-PCR缓冲液（20mMTris-Hcl,IOOmMNaCl，ρΗ8·3终浓度IX;[0033]dNTPs终浓度3mM;[0034]MgCl2终浓度为[0035]各ARMS引物对的上、下游引物的终浓度均为200nM;各ARMS引物对的Taqman以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为300nM;[0036]所述混合酶液包括：[0037]M-MLV逆转录酶终浓度2UyL;[0038]TaqDNA聚合酶终浓度0·05UyL;[0039]所述阳性对照品混合液中模板cDNA终浓度0.1〜lOngyL。[0040]本发明还提供了上述试剂盒在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点中的应用，包括以下步骤：[0041]1总RNA提取:提取待测样本的RNA，提到模板RNA溶液；[0042]2反应组分配制：分别配制检测混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物;其中，检测混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、模板RNA溶液5uL配制一人份；阳性对照品混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、阳性对照品混合液5uL配制一人份；阴性对照品混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、阴性对照品混合液5uL配制一人份；[0043]3扩增:分别将检测混合物、阳性质控品混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物放入荧光定量PCR仪扩增，按以下程度进行扩增：[0045]4结果判定:根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct值判定结果：当阳性对照品的Ct值小于等于35,或者检测混合物为阳性时，试剂盒有效；当阳性对照品的Ct值大于35，或者检测混合物无Ct值时，试剂盒无效或需重复检测。[0046]其中，步骤4中，根据检测混合物的Ct值定性判定，依据为:Ct40时，待测样本中无HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变;35彡Ct彡40时，待测样本可疑，需重检一次，重检结果如Ct40或无扩增曲线，则为待测样本中无HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变，反之则为待测样本中有HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变;Ct40时，待测样本中无HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变;3540或无扩增曲线，则为待测样本中无HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变，反之则为待测样本中有HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变;Ct彡35时，待测样本中有HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变产生。[0123]检测结果显示:本发明公开的试剂盒检测100份样本中，检测出12例样本有K65R突变位点，5例样本有K70E突变位点，25例样本有Q151M突变位点;实际测序法检测100份样本中，检测出10例样本有K65R突变位点，3例样本有K70E突变位点，20例样本有Q151M突变位点。[0124]从检测结果分析，本发明公开的试剂盒和RT-ARMS-TaqmanqPCR方法检测K65R，K70E，Q151M突变的灵敏度都超过直接测序法。

权利要求：I.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：RT-PCR混合液875uL;混合酶液125uL;阳性质控品45uL;阳性对照品混合液45uL;阴性对照品混合液45uL;其中，所述RT-PCR混合液包括：RT-PCR缓冲液，含20mMTris-Hcl、100mMNaCl，pH8.3终浓度IX;dNTPs终浓度3mM;MgCl2终浓度为1.6mM;3对上下游引物及3条探针；各ARMS引物对的上、下游引物的终浓度均为200nM;各ARMS引物对的Taqman以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为300nM;所述3对上下游引物及3条探针包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第65位、70位和151位突变位点K65R、K70E和Q151M的ARMS引物对和Taqman探针；K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记5’端和3’端；K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQl标记5’端和3’端；Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，分别用ROX和BHQl标记5’端和3,端;所述混合酶液包括：M-MLV逆转录酶终浓度2UyL;TaqDNA聚合酶终浓度0·05UyL;所述阳性对照品混合液中模板cDNA终浓度0.1〜IOngyL。

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