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申请/专利权人：广东海大畜牧兽医研究院有限公司
摘要：本发明公开一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2ORF1截短蛋白TTSuV2ORF1’的酵母表达及应用。本发明通过获取TTSuV2ORF1基因全序列、TTSuV2ORF1蛋白抗原性分析、对截短TTSuV2ORF1’序列的酵母表达、TTSuV2ORF1’截短蛋白的鉴定与纯化，获得真核表达的截短蛋白TTSuV2ORF1’，将该蛋白作为包被抗原用于TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，试剂盒具有较高的特异性、重复性及稳定性。本发明获得的截短表达的TTSuV2ORF1’重组蛋白还可以应用于猪Ⅱ型细环病毒亚单位疫苗中。
主权项：一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2‑ORF1截短蛋白的酵母表达方法，其特征在于其包括以下步骤：1TTSuV2 ORF1待表达片段的选择:以TTSuV2阳性样品的核酸为模板，在病毒基因序列的保守区设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，应用LA TaqDNA聚合酶扩增目的片段；对扩增产物进行电泳，切下目的条带，利用OMEGA胶回收试剂盒回收DNA，对纯化的片段进行测序，使用Clustal X软件包对测序结果进行序列匹配和多重序列比对，获取TTSuV2 ORF1序列SEQ ID NO:3；2TTSuV2 ORF1’片段的选择：应用ProtScale氨基酸分析软件在上述序列SEQ ID NO:3中选出预测抗原性较强且抗原区较为集中的序列为SEQ ID NO:4的蛋白片段TTSuV2 ORF1’；3TTSuV2 ORF1’的酵母表达：构建插入TTSuV2 ORF1’的pPICZαA重组质粒，电转化P.pastoris X‑33酵母菌，筛选重组TTSuV2 ORF1’的高拷贝子，获取真核表达的TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段；4TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段的鉴定与纯化：筛选出的高拷贝子，用50％硫酸铵沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，应用亲和层析的方法纯化重组TTSuV2 ORF1’，在PBS中透析后，应用BCA法进行定量，纯化后获得酵母表达的TTSuV2‑ORF1截短蛋白。
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