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申请/专利权人：北京化工大学

摘要：酿酒酵母分泌表达plantaricin A抑制植物乳杆菌的方法利用基因工程改造酿酒酵母，使之分泌植物乳杆菌素plantaricinAPlnA，从而抑制酿酒酵母乙醇发酵中植物乳杆菌染菌的方法，属于生物领域。酿酒酵母发酵生产生物乙醇属于生物化工领域。生物乙醇工业规模的生产常常受到乳酸菌污染的影响，其中植物乳杆菌对其危害最大。本发明旨在构建酿酒酵母工程菌，使其分泌表达植物乳杆菌素PlnA，从而对乳酸菌污染进行防控。本发明的工程菌InvScI-plnA长势较好，且可成功分泌PlnA，浓度约为20μgml，其培养上清液加入乳酸菌培养体系后，测量乳酸菌的生物量的变化，证明其对植物乳杆菌具有明显的抑菌效果。与现有的抗生素法相比，PlnA环境友好、对人体无害，具有较高的潜在商业价值和应用潜力。

主权项：酿酒酵母分泌表达plantaricin A抑制植物乳杆菌的方法，其特征在于：选用酿酒酵母Saccharomyces cerevistaeInvScI菌株作为宿主菌；植物乳杆菌Lactobacillus plantarumATCC BAA‑793作为植物乳杆菌素产生菌，具体操作如下：1将Lactobacillus plantarum ATCC BAA‑793接种于MRS培养基置于30～37℃恒温箱培养过夜，进行菌种复苏；将复苏后的菌液接种于MRS培养基，置于30～37℃恒温箱培养12～16h，离心收集菌体；使用细菌全基因组提取试剂盒获取Lactobacillus plantarumATCC BAA‑793全基因组；2按照plnA序列SEQ ID No.1设计plnA序列上下游引物SEQ ID No.2和plnA序列上下游引物SEQ ID No.3；根据Taq酶说明书设计程序进行PCR，扩增目的片段；利用T4连接酶将PCR产物与载体PMD‑19T‑Simple连接，转化进入大肠杆菌Top10中；3通过对载体和片段酶切位点分析，选定酶切位点KpnI和NotI，设计α‑factor的上游引物搭桥SEQ ID No.5、下游引物搭桥SEQ ID No.6、plnA的上游引物搭桥SEQ ID No.7和下游引物搭桥SEQ ID No.8，α‑factor的下游引物SEQ ID No.6与plnA的上游引物SEQ ID No.7序列反向互补；通过搭桥PCR在plnA上游加上分泌信号肽α‑factor，形成片段α‑factor‑plnA；使用KpnI和NotI对片段α‑factor‑plnA和质粒pYES2.0进行双酶切；使用T4连接酶将酶切后的片段与质粒连接形成载体pYES2.0‑plnA；将连接产物转化进入大肠杆菌Top10中；4利用质粒小提试剂盒提取质粒pYES2.0‑plnA，并通过醋酸锂转化进入酿酒酵母InvScI，利用尿嘧啶营养缺陷培养基筛选阳性克隆。

全文数据：酿酒酵母分泌表达PIantariCinA抑制植物乳杆菌的方法技术领域[0001]一种利用基因工程改造酿酒酵母，使之可以分泌植物乳杆菌素PlantaricinAPlnA，从而抑制酿酒酵母乙醇发酵中植物乳杆菌染菌的方法，属于生物技术领域。背景技术[0002]在乙醇发酵的工业生产中，染菌是长期制约发酵规模和持续发展的一个关键问题。在利用酿酒酵母发酵生产乙醇中，造成染菌的主要原因是设备的渗漏和空气的污染，发生染菌后发酵罐中的乳酸含量会升高，这说明在发酵过程中杂菌主要是乳酸菌。一旦染菌，发酵液条件适合植物乳杆菌的生长，乳酸菌生长繁殖力强，不仅会和酿酒酵母竞争营养成分和生存空间，其在代谢过程中产生的乳酸也会反过来抑制酿酒酵母的生长，发酵终期的乙醇产量和质量都会受到影响。[0003]目前，在发酵工业中通常通过添加抗生素来进行染菌防控方法，然而，其存在着效力降低、环境污染等问题。抗生素在后续蒸馏、纯化步骤中难以彻底分解，会在产品中有所残留。与此同时，由于抗生素的滥用，有抗性的菌株相继出现，抗性基因随着废水废渣排放进入环境，污染水源、土地等，给生态环境、人类的健康和安全造成影响造成更大的威胁，因而传统的染菌防控法一一抗生素法越来越难以获得大家的认可，寻找安全有效、环境友好的新型染菌防控方法刻不容缓。[0004]细菌素是由细菌生物合成的一类通常具有抑菌活性的蛋白质、多肽或前体多肽。其通常在对数其后期或稳定期前期，通过核糖体合成，对其同种近缘菌株呈现狭窄的活性抑制谱。普遍认为，由于细菌素已经存在于许多自古以来吃的食物，因而相比于抗生素更为安全。植物乳杆菌素PlnA属于IIc亚类细菌素，研究发现其抑菌谱较其他细菌素而言更窄，只对Lactobacilluscasei,Lactobacillussakei,Lactobacillusviridescens,Lactobacillusplantarum等几种乳酸菌有抑制作用，S卩其抑菌作用的特异性更强。本实验室前期研究证明了将PlnA用于酿酒酵母发酵生产乙醇过程中植物乳杆菌污染防控的可行性。目前查阅到的文献记录中尚未发现利用酿酒酵母对PlnA进行异源表达的报道。本课题组利用基因工程改造了酿酒酵母InvScI，构建了可以分泌植物乳杆菌素PlnA的工程菌InvScI-plnA，并证明其发酵上清液对植物乳杆菌具有明显的抑菌效果。发明内容[0005]本发明利用基因工程改造了酿酒酵母InvScI，使之可以分泌植物乳杆菌素PlnA，从而抑制酿酒酵母乙醇发酵中植物乳杆菌染菌，其核心是构建含有目的片段PlnA的质粒，并使其在酿酒酵母中有活性地分泌表达。具体包括以下步骤：[0006]1.酿酒酵母分泌表达plantaricinA抑制植物乳杆菌的方法，其特征在于：[0007]选用酿酒酵母SaccharomycescerevistaeInvScI菌株作为宿主菌;植物乳杆菌LactobacillusplantarumATCCBAA-793作为植物乳杆菌素产生菌，具体操作如下：[0008]1将LactobacillusplantarumATCCBAA-793接种于MRS培养基置于30〜37Γ恒温箱培养过夜，进行菌种复苏;将复苏后的菌液接种于MRS培养基，置于30〜37°C恒温箱培养12〜I6h，离心收集菌体；使用细菌全基因组提取试剂盒获取LactobacillusplantarumATCCBAA-793全基因组；[0009]2按照PlnA序列SEQIDNo.1设计PlnA序列上下游引物SEQIDNo.2和PlnA序列上下游引物SEQIDNo.3;根据Taq酶说明书设计程序进行PCR，扩增目的片段;利用T4连接酶将PCR产物与载体PMD-19T-SimpIe连接，转化进入大肠杆菌Top10中；[00Ί0]3通过对载体和片段酶切位点分析，选定酶切位点KpnI和NotI，设计α-factor的上游引物搭桥SEQIDNo.5、下游引物搭桥SEQIDNo.6、plnA的上游引物搭桥SEQIDNo.7和下游引物搭桥SEQIDNo.8，a-factor的下游引物SEQIDNo.6与plnA的上游引物SEQIDNo.7序列反向互补；通过搭桥PCR在pInA上游加上分泌信号肽α-factor，形成片段α-factor-plnA;使用KpnI和NotI对片段α-factor-plnA和质粒pYES2.0进行双酶切;使用Τ4连接酶将酶切后的片段与质粒连接形成载体PYES2.Ο-plnA;将连接产物转化进入大肠杆菌ToplO中；[0011]⑷利用质粒小提试剂盒提取质粒pYES2.0-plnA，并通过醋酸锂转化进入酿酒酵母InvScI，利用尿嘧啶营养缺陷培养基筛选阳性克隆。[0012]2.目的基因的诱导表达的方法，其特征在于：[0013]1取保存的权利要求1阳性克隆后菌种接入尿嘧啶缺陷培养基，于30〜35°C，180〜220rmp条件下过夜培养，进行菌种活化；[0014]其中，尿嘧啶缺陷培养基配方，IL培养基含有YNB6.7g，葡萄糖20.Og，氨基酸混合培养液，10.OmL;其中氨基酸混合培养液配方为：亮氨酸10.0gL;色氨酸10.0gL;组氨酸5.0gL;葡萄糖要单独灭菌；[0015]2按照OD6X=O.4〜0.6，将活化后的菌液接入50mL以半乳糖为唯一碳源的诱导培养基，培养36h，离心收集上清液；[0016]所用半乳糖诱导培养基，IL培养基含有YNB6.7g，半乳糖20.Og，氨基酸混合培养液，10.OmL;其中氨基酸混合培养液配方为:亮氨酸10.0gL;色氨酸10.0gL;组氨酸5.OgL;半乳糖要单独灭菌。[0017]进一步，步骤⑴所述培养温度为30°C。[0018]诱导酿酒酵母分泌表达植物乳杆菌素plantaricinA，应用于酿酒酵母发酵生物乙醇生产中乳酸菌的污染的防控。[0019]本专利创新点在于：1、植物乳杆菌素PlnA为天然产物，环境友好，对于人体健康无害，将其应用于植物乳杆菌的防控时相比于抗生素更加安全；2、成功构建了可分泌表达PlnA的酿酒酵母工程菌InvScI-plnA，构建的表达体系将可用于其他类似细菌素的表达。附图说明[0020]图1为表达载体PYES2.ο-plnA构建的流程图具体实施方式[0021]—、目的基因的获取[0022]1、取保存的菌种LactobacillusplantarumATCCBAA-793接种于新鲜的MRS培养基，置于30〜37°C恒温箱培养过夜，使菌种复苏。[0023]2、步骤1中所用MRS培养基配方，IL培养基含有:蛋白胨10.Og，牛肉膏10.Og，酵母膏5.Og，柠檬酸氢二铵2.Og，葡萄糖（C6H12O6·H2O20.Og，吐温-801.OmL，乙酸钠CH3COONa·3H205·Og，磷酸氢二钾Κ2ΗΡ〇4·3H202·Og，硫酸镁MgS〇4·7H200·58g，硫酸锰MnS〇4·H2O0·25g，培养基pH值为6·2。[0024]3、将复苏的LactobacillusplantarumATCCBAA-793接种于新鲜的MRS培养基，置于30〜37°C恒温箱培养12〜16h，离心收集菌体。使用细菌全基因组提取试剂盒获取LactobacillusplantarumATCCBAA-793全基因组作为PCR扩增DNA模板。[0025]4、按照plnA序列（SEQIDNo.1设计游引物，其上游引物如SEQIDNo.2所示，下游引物如SEQIDNo.3所示。通过PCR扩增目的片段plnA，包含以下步骤：[0026]步骤1:按如下比例配制反应体系：2XTaqPremix：50μΙ,上游引物：IpL[0027]下游引物：ΙμΙDNA模板：Ιμί〇.05，证明InvScI-P培养上清液不能对ATCC8014产生抑制作用；从培养开始9h起，处理组与对照组2之间产生明显差异，证明InvScI-plnA培养上清液对ATCC8014产生抑制作用，此抑制作用持续至发酵终期24h。乳酸菌生物量的减少量为13〜20%。[0076]本发明中上述实施例中的温度及时间等参数均为较优的选择，经实验证明在超出上述实施例范围外也能实现本发明的目的，因不能穷尽所有的数值，在此不再赘述。[0077]以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域的技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

权利要求：1.通过酿酒酵母分泌表达plantaricinA抑制植物乳杆菌的方法，其特征在于:选用酿酒酵母SaccharomycescerevistaeInvScI菌株作为宿主菌;植物乳杆菌LactobacillusplantarumATCCBAA-793作为植物乳杆菌素产生菌，具体操作如下：1将LactobacillusplantarumATCCBAA-793接种于MRS培养基置于30〜37°C恒温箱培养过夜，进行菌种复苏;将复苏后的菌液接种于MRS培养基，置于30〜37°C恒温箱培养12〜16h，离心收集菌体；使用细菌全基因组提取试剂盒获取LactobaciIlusplantarumATCCBAA-793全基因组；⑵按照PlnA序列SEQIDNo.1设计plnA序列上游引物SEQIDNo.2和plnA序列下游引物SEQIDNo.3;根据Taq酶说明书设计程序进行PCR，扩增目的片段;利用T4连接酶将PCR产物与载体PMD-19T-SimpIe连接，转化进入大肠杆菌Top10中；3通过对载体和片段酶切位点分析，选定酶切位点KpnI和NotI，设计α-factor的上游引物搭桥SEQIDNo.5、下游引物搭桥SEQIDNo.6、plnA的上游引物搭桥SEQIDNo.7和下游引物搭桥SEQIDNo.8，a-factor的下游搭桥引物SEQIDNo.6与plnA的上游搭桥引物SEQIDNo.7序列反向互补;通过搭桥PCR在plnA上游加上分泌信号肽α-factor，形成片段α-factor-plnA;使用KpnI和NotI对片段α-factor-plnA和质粒pYES2.0进行双酶切;使用T4连接酶将酶切后的片段与质粒连接形成质粒PYES2.Ο-plnA;将连接产物转化进入大肠杆菌ToplO中；4利用质粒小提试剂盒提取质粒pYES2.0-plnA，并通过醋酸锂转化进入酿酒酵母InvScI，利用尿嘧啶营养缺陷培养基筛选阳性克隆；5取步骤（4筛选所得的阳性克隆菌种接入尿嘧啶缺陷培养基，于30〜35°C，180〜220rmp条件下过夜培养，进行菌种活化；其中，尿嘧啶缺陷培养基配方，IL培养基含有YNB6.7g，葡萄糖20.Og，氨基酸混合培养液，10.OmL;其中氨基酸混合培养液配方为:亮氨酸10.OgL;色氨酸10.OgL;组氨酸5.OgL;葡萄糖要单独灭菌；⑹按照OD6qq=O.4〜0.6，将活化后的菌液接入50mL以半乳糖为唯一碳源的诱导培养基，培养36h，离心收集上清液；所用半乳糖诱导培养基，IL培养基含有YNB6.7g，半乳糖20.Og，氨基酸混合培养液，10.OmL;其中氨基酸混合培养液配方为:亮氨酸10.0gL;色氨酸10.0gL;组氨酸5.0gL;半乳糖要单独灭菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑴所述培养温度为30°C。

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