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申请/专利权人：中国农业大学

摘要：本发明涉及分子生物学及生物检测领域，具体公开了基于环介导等温扩增消光技术的转基因大豆GTS40‑3‑2检测引物及检测方法与试剂盒。本发明针对转基因大豆GTS40‑3‑2转化事件3’端基因的部分区域设计4条特异性引物，利用环介导等温扩增消光技术使用所述引物对样品的DNA进行扩增，通过判定反应颜色或吸光值的变化判断是否有扩增产物，从而判断是否存在转基因大豆GTS40‑3‑2转。所述方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、肉眼判定结果等优点，为转基因大豆GTS40‑3‑2检测提供了有效、快速的检测方法。

主权项：基于环介导等温扩增消光技术的转基因大豆GTS40‑3‑2检测引物，其特征在于，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物，序列分别为：上游外引物GTS40‑3‑2‑F3：CTGGGAGGGAGGGAGGGGGAGTAGTACACTCACCAGT；下游外引物GTS40‑3‑2‑B3：CTGGGAGGGAGGGAGGGGCATTCGAGCTTCTTCAC；上游内引物GTS40‑3‑2‑FIP：ACAACGAGAAGCTATATGTAGACTGGGAGGGAGGGAGGGGCGACCCTAATAGGCAACAGC；下游内引物GTS40‑3‑2‑BIP：CAAAACTATTTGGGATCGGAGCTGGGAGGGAGGGAGGGGAGAACTTCTCGACGATGGC。

全文数据：基于环介导等温扩増消光技术的转基因大豆GTS40-3-2检测引物及检测方法与试剂盒技术领域[0001]本发明涉及分子生物学及生物检测领域，具体地说，涉及基于环介导等温扩增消光技术的转基因大豆GTS40-3-2检测引物及检测方法与试剂盒。背景技术[0002]转基因抗草甘膦除草剂大豆GTS40-3-2作为目前在最多国家和地区批准种植的转基因大S，除棒取大S油外，剩余的S柏等副广品被用作动物伺料。[0003]环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplificationmethod，LAMP是Notomi等于2000年发明的一种新型的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNApolymerase在等温条件下（60-65°C反应，在Ih内即可完成核酸扩增反应，目的片段可以扩增IO9倍。该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、省时、操作简单等优点，在核酸检测方面具有明显优势。目前环介导等温检测技术的产物检测方法主要有浊度法、染料法、电泳法以及核酸试纸条，但是这些方法都容易引起交叉污染。发明内容[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供基于环介导等温扩增消光技术的转基因大豆GTS40-3-2检测引物及检测方法与试剂盒。该检测方法操作简便，不依赖昂贵仪器且对操作人员要求低，方法准确无污染。针对转基因大豆GTS40-3-2的转化事件3'端基因检测，可实现对待测样品中转基因大豆GTS40-3-2成分的现场快速检测。[0005]为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：[0006]第一方面，本发明针对转基因大豆GTS40-3-2转化事件3'端为靶基因设计了基于环介导等温扩增消光技术的转基因大豆GTS40-3-2检测引物，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物，序列分别为：[0007]上游外引物GTS40-3-2-F3:CTGGGAGGGAGGGAGGGGGAGTAGTACACTCACCAGT;[0008]下游外引物GTS40-3-2-B3:CTGGGAGGGAGGGAGGGGCAITCGAGCTTCTTCAC;[0009]上游内引物GTS40-3-2-FIP:ACAACGAGAAGCTATATGTAGACTGGGAGGGAGGGAGGGGCGACCCTAATAGGCAACAGC；[0010]下游内引物GTS40-3-2-BIP:CAAAACTATTTGGGATCGGAGCTGGGAGGGAGGGAGGGGAGAACTTCTCGACGATGGCo[0011]核酶是一种具有类过氧化物酶活性、富含鸟嘌呤的单链DNA分子，在特定的条件下能够折叠成G4重结构，在H2O2存在下能够催化无色底物2^-连氮基-双-3-乙基并二氢噻唑啉-6-磺酸）二价阴离子ABTS2-氧化成蓝绿色物质ABTS-•自由基。当存在单链DNA分子的互补链时，这种类过氧化物酶的活性降低甚至消失。将折中显色消光技术结合到环介导等温扩增技术上，利用引物显色，产物消光的手段，来验证目的片段的存在。[0012]本发明通过巧妙地设计引物，使引物既可高效扩增转基因大豆GTS40-3-2转化事件3'端，又可作为具有类过氧化物酶活性单链DNA核酶，实现上述功能。[0013]第二方面，本发明提供了一种扩增效率高、准确度高的检测转基因大豆GTS40-3-2的方法，即利用环介导等温扩增消光技术用前述引物对样品的DNA进行扩增，通过检测是否有扩增产物来判断是否存在转基因大豆GTS40-3-2。有扩增产物时，判断样品中含有转基因大豆GTS40-3-2成分。[0014]具体包括如下步骤：[0015]⑴提取样品基因组模板:将样品磨成粉末，称l〇〇mg±l〇mg样品，用CTAB方法提取基因组；[0016]2显色反应：将hemin工作液与前述引物混合，在35~45°C条件下孵育20~30min，添加ABTS显色液和H2O2后得到显色反应混合液，立刻判定颜色或通过紫外分光光度计在419nm处测定吸光值；[0017]3环介导等温扩增消光反应：向显色反应混合液中添加样品基因组模板，在60~65°C进行环介导等温扩增消光反应40~60min;[0018]4产物检测：目视判定反应颜色，或通过紫外分光光度计在419nm处测定吸光值，通过与步骤2得到的颜色或吸光值进行比较，判断是否有扩增产物。[0019]判定颜色由蓝色变浅或变为无色，或者吸光值减小，可判定有目的扩增产物。[0020]作为优选，步骤（2中，将40~60福的hemin工作液与1.25福的GTS40-3-2-F3和GTS40-3-2-B3以及10處的GTS40-3-2-FIP和GTS40-3-2-BIP混合，在35~45°C条件下孵育20~30min，添加30~40mM的ABTS显色液和50~60mM的H2O2后得到显色反应混合液，立刻判定颜色或测定吸光值。[0021]为了更好的实现核酶的类过氧化物酶的活性，更为优选，向50yMhemin工作液中添加1•25yM外引物GTS40-3-2-F3和GTS40-3-2-B3，IOyM内引物GTS40-3-2-FIP和GTS40-3-2-BIP，40°C孵育30min，然后添加36mMABTS显色液和60mMH2O2，立即判定颜色，测定0D419。在该体系下进行显色反应，能够保证引物形成稳定的G4结构，与hemin最大程度结合，展现出更好的类过氧化物酶活性，在过氧化氢存在的条件下，最大程度的氧化ABTS底物。[0022]作为优选，步骤（3中，向显色反应混合液中添加1.4~2.0mMdNTP、3~8mM1%504、0.6~0.811甜菜碱、3.6~10.01]88七0嫩聚合酶大片段、1叉1116现^〇1131^€61，2此样品基因组模板，在60~65°C反应40~60min。反应所使用的仪器为水浴锅或金属浴。[0023]为了更好的实现后续环介导等温扩增，更为优选，向显色反应混合液中添加1.6mMdNTP、6mMMgS〇4、0.8M甜菜碱，8.0UBstDNA聚合酶、lxThermopolbuffer。扩增反应程序:65°C反应40min，终止反应。在该体系下进行能够保证引物的扩增效率不受影响，在短时间内实现快速扩增，保证尽可能多的核酶引物形成双链产物，从而失去类过氧化物酶活性，使得反应体系消光。[0024]进一步地，hemin工作液由hemin溶于工作液配制，hemin的终浓度为40~60tiM，优选5MLABTS显色液是由ABTS粉剂溶于IXDMSO缓冲液配制，ABTS的终浓度为30~40mM，优选36mM，且现用现配。[0025]进一步地，所述工作液含有IOmMNaH2P〇4、100mMKCl、2mMMgCl2以及0.003%wwTritonX-100，由CldH2O配置。[0026]第三方面，本发明提供了一种环介导等温扩增消光技术检测转基因大豆GTS40-3-2的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物，工作液，hemin，ABTS粉剂，DMSO缓冲液，30%wwH2O2,以及lxThermopol131^€61'、11'013、]\%3〇4、甜菜碱组成的反应液和138七0嫩聚合酶;所述工作液含有IOmMNaH2P〇4、100mMKCl、2mMMgCl2以及0.003%TritonX-IOO0[0027]作为优选，所述反应液是由体积比为5:8:1:10的lxThermopolbuffer、I•4~2.0mMdNTP、3~8mMMgS〇4和0.6~0.8M甜菜碱组成。[0028]在所述试剂盒中，所述引物以引物混合液的形式存在，所述引物混合液中含有1.25虚的GTS40-3-2-F3和GTS40-3-2-B3与IOyM的GTS40-3-2-FIP和GTS^U-BIPaBstDNA聚合酶冻干在PCR管内底部。[0029]其中，所述引物混合液、工作液、ABTS粉剂、DMSO缓冲液、30%H2O2可常温保存，反应液（lxThermopol131^6广1犯1\1%3〇4、甜菜碱）需4°：保存，88七0祖聚合酶需-20°：保存。[0030]本发明进一步提供了所述试剂盒在检测转基因大豆GTS40-3-2中的应用。[0031]本发明的有益效果在于：[0032]1、反应快速，一般情况下在15~30min即可有大量的扩增产物生产，为了保证检测的准确度，本发明选择反应时长为40min，在此时间内即可将模板扩增IO9倍，该方法操作简便，适于核酸分子的快速检测。[0033]2、特异性好，该技术对靶基因的部分区域设计引物，引物具有更高的特异性。[0034]3、灵敏度高，该技术反应速度快，对于痕量目的基因可以达到很好的检测效果，灵敏度比PCR方法高一到两个数量级，该技术为转基因产品的监督检测提供了技术支持。[0035]4、操作简单，适于基层使用。本发明设计了检测转基因大豆GTS40-3-2的试剂盒，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层检测使用。附图说明[0036]图1为本发明实施例2中转基因大豆GTS40-3-2的LAMP反应产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，1泳道为阴性扩增，2泳道为样品扩增，M为DL2000DNAmaker。[0037]图2为本发明实施例3中试剂盒特异性反应产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道从左至右分别为转基因大豆GTS40-3-2,转基因大豆M0N89788,非转基因大豆，转基因玉米M0N810，转基因玉米Bt176，转基因水稻TT51-1，转基因水稻KF6和阴性对照。[0038]图3为本发明实施例3中试剂盒特异性反应产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道从左至右为不同浓度基因组，其浓度分别为l〇5，l〇4，l〇3，l〇2，l〇，lpg。具体实施方式[0039]下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。[0040]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0041]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0042]实施例1转基因大豆GTS40-3-2检测方法的建立[0043]1将转基因大豆GTS40-3-2籽在液氮中研磨粉碎，称取IOOmg用CTAB方法提取基因组。[0044]2通过日本荣岩株式会社环介导引物在线设计软件LAMPprimerdesigningsoftwareprimerexplorerV4.0http:primerexplorer.jpelamp4.0.0index.html针对转基因大豆GTS40-3-2转化事件3'端基因的部分区域设计引物：[0045]上游外引物GTS40-3-2-F3:CTGGGAGGGAGGGAGGGGGAGTAGTACACTCACCAGT;[0046]下游外引物GTS40-3-2-B3:CTGGGAGGGAGGGAGGGGCAITCGAGCTTCTTCAC;[0047]上游内引物GTS40-3-2-FIP:ACAACGAGAAGCTATATGTAGACTGGGAGGGAGGGAGGGGCGACCCTAATAGGCAACAGC；[0048]下游内引物GTS40-3-2-BIP:CAAAACTATTTGGGATCGGAGCTGGGAGGGAGGGAGGGGAGAACTTCTCGACGATGGCo[0049]引物由上海英潍捷基有限公司合成，将引物稀释为lOwiiolL。[0050]3对影响环介导等温扩增技术的因素（dNTPs、甜菜碱、引物、Mg2+、BstDNA聚合酶、温度、反应时间）进行了优化，确定最优的LAMP扩增反应体系：1.6mMdNTP、6mMMgSO4、0•8M甜菜碱，I•25yM外引物（GTS40-3-2-F3，GTS40-3-2-B3、10處内引物GTS40-3-2-FIP，GTS40-3-2-BIP，8.0UBstDNA聚合酶、lxThermopolbuffer。扩增反应程序：65°C反应40min，85°C放置3min，终止反应。[005114对影响显色反应的因素hemin、孵育温度、时间、ABTS、H2O2进行了优化，确定最优的显色消光反应体系：50處hemin工作液，添加1.25yM外引物GTS40-3-2-F3和GTS40-3-2-B3，10處内引物GTS40-3-2-FIP和GTS40-3-2-BIP，40°C孵育30min，然后添加36mMABTS显色液，60mMH2O2，立即判定颜色，测定OD419。[0052]5向显色反应终混合液中添加LAMP扩增反应液，65°C反应40min。[0053]6结果分析:扩增后颜色由蓝色变浅或无色，或OD419值变小，说明含有目的产物。[0054]实施例2试剂盒检测样品中转基因大豆GTS40-3-2成分[0055]1基因组模板的提取:称IOOmg粉状样品，用CTAB方法提取基因组。[0056]2显色反应：配制50虚hemin工作液、40mMABTS显色液以及60mMH2〇2,在含有BstDNA聚合酶冻干粉的PCR管中配制反应体系，添加引物混合物9yL，hemin反应液90yL，40°C孵育30min，添加ABTS显色液29yL以及IyLH2O2，立即判定颜色，测定OD419。[0057]3环介导等温扩增消光反应:上述混合液中，添加反应液12此，DNA模板2此，65°C水浴锅中反应40min，判定颜色，测定OD419。[0058]4结果分析：显色反应液最初呈蓝色，0D419为0.65428和0.64867，扩增后，含有样品基因组的反应液接近无色，00419为0.07516,阴性对照为不添加基因组模板反应液仍然呈蓝色，0D419为0.63189，由此判定含有转基因大豆GTS40-3-2成分。[0059]与此同时，为了验证上述检测结果的准确性，对LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1。由图1可知，样品扩增产物显示出阶梯状的条带，与GTS40-3-2转化事件中转基因序列3'端及侧翼序列结合区的结果一致，因此判定样品含有转基因大豆GTS40-3-2成分，与上述检测结果一致，即本发明所述检测引物与检测方法可行。[0060]实施例3试剂盒检测样品中转基因大豆GTS40-3-2的特异性及灵敏度[0061]1样品基因组模板制备：称IOOmg粉状样品，用CTAB方法提取基因组，样品包含：转基因大豆GTS40-3-2，转基因大豆M0N89788，非转基因大豆，转基因玉米M0N810，转基因玉米Btl76,转基因水稻TT51-1和转基因水稻KF6。灵敏度验证时将转基因大豆GTS40-3-2基因组的浓度调整为105pgyL，然后将此浓度的基因组10倍倍比稀释为104,IO3，IO2，10,lpgyL，制备成系列剃度浓度的标准DNA模板。[0062]2显色反应：配制50虚hemin工作液、40mMABTS显色液以及60mMH2O2,在含有BstDNA聚合酶冻干粉的PCR管中配制反应体系，添加引物混合物9yL，hemin反应液90yL，40°C孵育30min，添加ABTS显色液29yL以及IyLH2O2，立即判定颜色，测定OD419。[0063]3环介导等温扩增消光反应:上述混合液中，添加反应液12此，DNA模板2此，65°C水浴锅中反应40min，判定颜色，测定OD419。[0064]4结果分析:显色反应液最初呈蓝色，OD419见下表，扩增后，含有样品基因组的反应液接近无色，OD419降低，阴性对照为不添加基因组模板反应液仍然呈蓝色，OD419维持不变，由此判定含有转基因大豆GTS40-3-2成分。[0065][0066]与此同时，为了验证上述检测结果的准确性，对LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图2和图3所示。由图2可知，只有转基因大豆GTS40-3-2中扩增出阶梯状的条带，其他转基因样品没有目的条带，与上述检测结果一致，即本发明所述检测引物与检测方法具有很好的特异性。由图3可知，当基因组浓度稀释到Ipg时没有阶梯状的条带，其他浓度有目的条带，与上述检测结果一致，即本发明所述检测引物与检测方法具有很好的灵敏度，检测限为l〇pg。[0067]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.基于环介导等温扩增消光技术的转基因大豆GTS40-3-2检测引物，其特征在于，所述弓丨物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物，序列分别为：上游外引物GTS40-3-2-F3:CTGGGAGGGAGGGAGGGGGAGTAGTACACTCACCAGT;下游外引物GTS40-3-2-B3:CTGGGAGGGAGGGAGGGGCATTCGAGCTTCTTCAC;上游内弓|物GTS40-3-2-FIP:ACAACGAGAAGCTATATGTAGACTGGGAGGGAGGGAGGGGCGACCCTAATAGGCAACAGC；下游内弓|物GTS40-3-2-BIP:CAAAACTATTTGGGATCGGAGCTGGGAGGGAGGGAGGGGAGAACTTCTCGACGATGGC〇2.-种检测转基因大豆GTS40-3-2的方法，其特征在于，利用环介导等温扩增消光技术用权利要求1所述的引物对样品的DNA进行扩增，通过检测是否有扩增产物来判断是否存在转基因大豆GTS40-3-2。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：1提取样品基因组t旲板；2显色反应:将hemin工作液与权利要求1所述引物混合，在35~45°C条件下孵育20~30min，添加ABTS显色液和H2〇2后得到显色反应混合液，立刻判定颜色或通过紫外分光光度计在419nm处测定吸光值；3环介导等温扩增消光反应：向显色反应混合液中添加样品基因组模板，在60~65°C进行环介导等温扩增消光反应40~60min;4产物检测：目视判定反应颜色，或通过紫外分光光度计在419nm处测定吸光值，通过与步骤2的结果比较，判断是否有扩增产物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2中，将40~60μΜ的hemin工作液与1·25μΜ的GTS40-3-2-F3和GTS40-3-2-B3以及ΙΟμΜ的GTS40-3-2-FIP和GTS40-3-2-BIP混合，在35~45°C条件下孵育20~30min，添加30~40mM的ABTS显色液和50~60mM的Η2〇2后得到显色反应混合液，立刻判定颜色或测定吸光值。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤3中，向显色反应混合液中添加1.4~2.0mMdNTP、3~8mMMgS〇4、0.6~0.8Μ甜菜碱、3.6~10.0UBstDNA聚合酶大片段、lxThermopolbuffer，2yL样品基因组模板，在60~65°C反应40~60min。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述hemin工作液由hemin溶于工作液配制，所述工作液含有10mMNaH2P〇4、100mMKCl、2mMMgCh以及0.003%TritonX-100〇7.-种环介导等温扩增消光技术检测转基因大豆GTS40-3-2的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括工作液，hemin，ABTS粉剂，DMS0缓冲液，30%H2〇2,以及lxThermopolbuffer、dNTP、MgS〇4、甜菜碱组成的反应液和BstDNA聚合酶；所述工作液含有10mMNaH2P〇4、100mMKCl、2mMMgCl2以及0.003%1'1'；11:〇11乂-100;所述反应液是由体积比为5:8:1:10的]^1'1161'1]1^〇1131^€61'、1.4~2.〇111]\1dNTP、3~8mMMgS〇4和0·6~0·8M甜菜碱组成。9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，权利要求1所述的引物以引物混合液的形式存在，所述引物混合液中含有1.25μΜ的GTS40-3-2-F3和GTS40-3-2-B3与10μΜ的GTS40-3-2-FIP和GTS40-3-2-BIP。10.权利要求7~9任一项所述的试剂盒在检测转基因大豆GTS40-3-2中的应用。

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