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申请/专利权人：西南大学

摘要：本发明涉及作物病害防治技术领域，尤其涉及一种植物抗病基因NtWRKY50及其在烟草抗青枯病中的应用，本发明的植物抗病基因NtWRKY50的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明进一步将NtWRKY50基因转入到烟草中进行功能验证，结果表明，NtWRKY50是一个核定位蛋白，其表达受到植物青枯病病原菌侵染的诱导；NtWRKY50的过表达能增强烟草对青枯病的抗性，NtWRKY50基因的沉默对植物病害抗性没有显著影响；NtWRKY50可以被各种生物胁迫或非生物胁迫诱导；NtWRKY50过表达显著促进SA水平，但抑制病原物诱导的JA积累。这些数据表明NtWRKY50过表达导致SA和JA含量的改变，防御相关基因的表达增加，并增强植物对青枯菌的抗性。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。

主权项：一种植物抗病基因NtWRKY50，其特征在于，所述NtWRKY50基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

全文数据：一种植物抗病基因NtWRKY50及其在烟草抗青枯病中的应用技术领域[0001]本发明涉及作物病害防治技术领域，尤其涉及一种植物抗病基因NtWRKY50及其在烟草抗青枯病中的应用。背景技术[0002]青枯病是由青枯雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum;青枯菌）引起的土传维管束病害。青枯菌是全世界最具破坏性的植物病原菌之一，在十大植物致病细菌中排名第二。青枯菌侵染50多个科，超过45〇种植物，包括茄科作物，香蕉、花生、姜、观赏植物和林木，其中茄科作物主要以番茄、马铃薯、烟草、辣椒为代表，并且新的品种、新的寄主还不断被报道。由于其广泛的宿主范围和地理分布，在世界范围内造成严重经济损失（15%〜95%，以热带地区发展中国家最为严重，是许多农作物及经济作物生产上的重要限制因子。仅在马铃薯上，全球每年损失10亿美元；Elphinstone，2〇05#1088。温室效应导致的气温升高，使其分布范围向更高纬度的地区扩展。由于缺乏有效根除措施，污染土地连续生产以及病原具有在潮湿土壤、水池、植物残体或者无症状杂草宿主上生存多年的能力，此病害一直难以防治。目前防治青枯病的主要方法是使用化学农药和农业措施，但是由此带来诸多问题，如污染环境，诱导病原菌产生抗性等。因此，抗病品种的应用尤为重要。[0003]植物抗病性反应机制十分复杂多样，植物与病原物的互作，抗病信号的转导及防卫反应的发生过程中存在着一系列的调节因子和基因，并形成复杂的调控网络。信号分子可以通过不同的途径产生，同一病原也可能激发不同的抗病信号。近年来，国内外不少研究者正致力于寻找与抗病有关的基因和抗病机制的研宄，各种转基因抗病植株相继建成并应用到农业生产中。植物抗病机理的研宄以及植物基因工程技术的应用不但为农作物品种的改良开辟了一条新的途径，同时还为还将对保护环境和维持生态平衡提供新思路，具有特别重要的研究意义和广阔的应用前景。[0004]近年来，越来越多的证据表明，一些WRKY转录因子在植物中过表达或沉默时可以影响抗病性。拟南芥作为模式作物，其WRKY蛋白的研究成果最多，已经证实WRKY蛋白是植物抗性的负调控因子，如拟南芥4七11?1^41^1，2008#620、4七11?1^27说111^^312008#624、八谓1«¥1117加11«1〇。七1111〇,2〇〇6#1557和六價1?1^48以1叫，2008#1567。也有研究发现拟南芥WRKY蛋白正调植物抗性，如AtWRKY75Encinas-Vi1larejo,2009#1569和AtWRKY34Lai,20〇8#l555以及3个部分功能冗余的WRKY基因，AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60Xu,2006#348〇[0005]此外，还发现多个WRKY转录因子调节植物对青枯菌的防御反应。例如，拟南芥R蛋白RRS1AtWRKY52通过特异性识别从青枯菌分泌的III型效应蛋白PopP2来激活ETI应答Deslandes等人，2〇〇2;Deslandes等人，20〇3。辣椒（CapsicumannuumCaWRKY40和棉花GossypiumhirsutumGhWRKY39-l均可以增强烟草对青枯菌抗性或耐受性Dang,2013#1333、（Shi，2014#350;相反，GhWRKY40Wang,2014#351、CaWRKY58Wang，2013#361、AtWRKY53Hu，2008#530以及AtWRKY27Mukhtar，2008#1571负调节植物对青枯菌的抗性。[0006]本发明针对以上背景技术，研究基于以前的转录组数据，在烟草感染青枯病的过程中，鉴定到一个WRKY类似基因被显著诱导，核苷酸BLAST表明预测的WRKY类似基因与NtWRKY50具有100%相似性，命名为NtWRKY50。通过构建过表达和RNAi转基因烟草植株，进行抗性以及防御相关基因的表达测定，推测NtWRKY50可能参与烟草的防御反应，为植物抗青枯病的分子机理提供理论基础。发明内容[0007]有鉴于此，本发明的目的是提供一种植物抗病基因NtWRKY50及其在烟草抗青枯病中的应用，为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。[0008]本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：[0009]一种植物抗病基因NtWRKY50,所述NtWRKY50基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。所述NtWRKY50基因编码的氨基酸序列如SEQID衝.2所示^1¥1«^50基因能够显著提高植物青枯菌抗性能力。[0010]本发明基于以前的转录组数据，在烟草感染青枯病的过程中，鉴定到一个WRKY类似基因被显著诱导。核苷酸BLAST表明预测的WRKY类似基因与NtWRKY50具有100%相似性，命名为NtWRKY50。根据其预测的cDNA序列设计引物，用QRT-PCR分析其表达模式。根据预测的NtWRKY50cDNA序列设计引物，进行聚合酶链反应扩增该基因，结果表明，NtWRKY50序列为576个碱基对，编码191个氨基酸，其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。NtWRKY50编码的蛋白含有WRKY结构域WRKYGKK以及锌指基序CX4CX23HXH，与典型的WRKYGQK序列相比，其中有一个碱基G被K的取代，其编码的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。[0011]另外，本发明还提供了包含植物抗病基因NtWRKY50的过表达载体，以及所述过表达载体的构建方法:采用cDNA作为模板进行NtWRKY5〇PCR扩增，上游引物加入BglII酶切位点，下游引物加入BstEH酶切位点，并在蛋白末端引入6个HIS蛋白，电泳切胶回收PCR扩增NtWRKY5〇片段，双酶切后连接到pVCT2〇24表达载体上，置于CaMV35S启动子下游，得到CaMV35S启动子驱动NtWRKY5〇基因的过表达载体。NtWRKY50的过表达可以抑制青枯菌的的生长和延缓烟草萎蔫症状的发展。[0012]此外，本发明还提供了包含植物抗病基因NtWRKY50的RNAi干扰载体，以及所述RNAi干扰载体的构建方法:采用pBWAVHS载体，PCR扩增NtWRKY50的正向靶标、反向靶标和中间的loop，再通过酶切连接反应，插入到CaMV35S启动子下游。NtWRKY50基因的RNAi干扰载体不会导致烟草植株对青枯菌抗性的改变。[0013]最后，本发明还公开了所述的植物抗病基因NtWRKY50或所述的过表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用，构建过表达载体将NtWRKY50置于CaMV35S启动子下游，通过农杆菌介导转化，得到过表达NtWRKY50的转基因烟草植株，对其进行抗性鉴定，结果证明NtWRKY50基因可以正调控烟草对青枯菌的抗性。[0014]本发明的植物抗病基因NtWRKY50可以正调控烟草对青枯菌的抗性，且干扰NtWRKY50表达不会改变烟草抗病性，另外，NtWRKY5〇正调激素介导的防御途径，尤其是在受至丨J病原侵染之后，此外，NtWRKYf50响应各种激素或者胁迫诱导，其中激素的诱导较好。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。附图说明[0015]图1是本发明NtffRKY5〇基因过表达载体构建中表达载体PVCT2040的图谱；[0016]图2是本发明含NtffRKY50基因的RNAi干扰载体的图谱；[0017]图3是本发明NtWRKY50基因在青枯菌浸染期间的表达情况，其中，3A为接种青枯菌的云烟87烟草植株的症状，3B为青枯菌在烟草根中的生长情况图，3C为接种青枯菌后云烟87中NtffRKY50的相对表达量图；[0018]图4为本发明NtWRKY5〇编码的蛋白中含有WRKY结构域WRKYGKK以及锌指基序与典型的WRKYGQK序列比较图；[0019]图5为本发明WRKY转录因子的分组图；[0020]图6为本发明NtWRKY50的亚细胞定位结果图；[0021]图7为本发明NtWRKY5〇过表达对青枯病害的抗性影响图，其中，7A为QRT-PCR检测NtWRKY50在不同过表达转基因植株系中的表达水平图，7B为NtWRKY50-0E2和WT植株接种青枯菌后的发病率统计图，7C为NtWRKY5〇-〇E2和WT根中青枯菌的生长情况统计图；[0022]图8为本发明青枯菌浸染烟草的组织化学染色图，其中，8A为3,3’-二氨基联苯胺染色，8B为硝基蓝四氮唑染染色；[0023]图9为本发明NtWRKY50的RNAi干扰载体对青枯病害的抗性影响图，其中，9A为QRT-PCR检测NtWRKY50在不同RNAi转基因植株系中的表达水平图，9B为NtWRKY50_0E2和WT植株接种青枯菌后的发病率统计图，9C为NtWRKY50-0E2和WT根中青枯菌的生长情况统计图；[0024]图10为本发明青枯菌接种前后防御相关基因的QRT-PCR分析柱状图；其中，10A为接菌前的QRT-PCR分析图，10B是接菌Id后的QRT-PCR分析图；[0025]图11为本发明的内源自由SA和JA含量柱状图。具体实施方式[0026]以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明：[0027]本发明的一种植物抗病基因NtWRKY50的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。该财化狀丫50基因编码的氨基酸序列如8£〇10奶.2所示。[0028]本发明使用的培养基如下：[0029]TTC1L:酪朊水解物lg，蛋白胨10g，葡萄糖l〇g，琼脂20g，pH=7.0,培养基用前融化并冷却至50°C后加入TTC2，3，5氯化三苯基四氮挫〇•〇5g;[0030]NB1L:牛肉浸膏3g，酵母粉lg，蛋白胨5g，葡萄糖10g，pH=7.0;[0031]YEB1L:牛肉浸膏5g，酵母浸膏lg，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgS04•H200.5g，pH=7.0;[0032]LB1L:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠l〇g，琼脂15g;[0033]311〇比:蛋白胨1^，甘油511^，酪蛋白水解物1邑，去离子水1〇〇〇1111^11=7.0〜7.2，琼脂粉15g，121°C灭菌20分钟。培养基用前融化并冷却至5〇°C后加入下列物质：100mgL多粘菌素B，5mgL结晶紫，50mgL氯化三苯基四氮唑盐，25mgL杆菌肽，0.5mgL青霉素，5mgL氯霉素，1〇〇mgL放线菌酮。[0034]实施例一:制备无菌烟苗[0035]本实施例使用来自重庆市烟草公司的野生型烟草云烟种子，用质量浓度为75%的酒精溶液浸泡1分钟，取出用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡10分钟后，取出用灭菌水清洗5次，播种于青岛海博生物技术有限公司提供的MS固体培养基上，置于人工气候箱25〜28°C，光照周期为16h光照8h黑暗的气候室培养生长。[0036]实施例二:构建NtWRKY50基因过表达载体和RNAi干扰载体[0037]荧光实时定量PCR:用天根生化科技有限公司提供的植物总RNA提取试剂盒提取RNA，BI〇-RADcDNASynthesisKit合成cDNA，荧光定量PCRQRT-PCR采用BI0-RAD，ClOOOTouch™ThermalCycler，SsoFAST™EvaGreenSupermix，检测系统为CFX96real_timesystenuPCR扩增反应体系为20ul，含有l〇ylSYBRmix，lylcDNA，lyl正向引物，lul反向引物和7ylH20。反应条件:95°C3min，40个循环:95°C10s，55°C30s。每个PCR反应在三个生物重复进行，并通过2_AAGt方法计算基因表达。内参基因为UBI3和NtEFla。[0038]本实施例的过表达载体构建中使用的表达载体是来自西南大学园艺学院张兴国老师的PVCT2024载体，其图谱如图1所示。采用cDNA作为模板进行NtWRKY50PCR扩增，上游引物加入Bglll酶切位点，下游引物加入BstEII酶切位点，并在蛋白末端引物6个HIS蛋白，电泳切胶回收PCR扩增NtWRKY50片段，双酶切后连接到PVCT2024表达载体的质粒大片段上，插入到CaMV35S启动子下游，得到CaMV35S启动子驱动NtWRKY50基因的过表达载体。转化大肠杆菌DH5a，涂板于LB+Kan，克隆PCR验证阳性克隆，并送华大基因测序。挑选正确克隆提取质粒天根质粒小提试剂盒转化农杆菌EHA105，克隆PCR验证阳性克隆。在YEB+Kan中液培养48h，吸取0•2mL加入等量50%灭菌甘油保存于-80。：。[0039]NtWRKYM基因的RNAi干扰载体构建:采用pBWAVHS载体，首先PCR扩增NtWRKY50的正向靶标、反向靶标和中间的loop，再在37。：的温度条件下，酶切连接反应2h，插入到CaMV35S启动子下游。每l〇ul酶切连接反应体系如下：l〇〇pl.5ul，正向和反向祀标各1.5以1，空载体1•如1，Ec〇3l10.邱1，T4连接酶0•5ul，T4缓冲液lul，ddlfeO补至l〇ul〇NtWRKY50基因的RNAi千扰载体的图谱如图2所示。[0040]实施例三:培养转基因烟草植株[0041]步骤一:将含有NtWRKY5〇基因己构建好质粒的EHA105菌液在YEB+Kan平板上划线，于2〇C培养48h，挑单克隆至f5mLYEB培养基中于280rpm、28°C培养48h，按照1:100〜1:50的比例扩大培养50mL过夜，至光密度0D=0•6，然后离心收集菌体，用50mL青岛海博生物科技有限公司提供的MS液体培养基悬浮，得到浸染菌液，备用。[0042]步骤二:将上述准备好的农杆菌菌液取10mL左右转移到一个空的无菌培养皿中，烟草叶片去中脉和叶缘，切成0•5〜0.8cmX0.5〜0.8cm的均匀小片;将叶片转移到浸染菌液中，轻轻振荡浸染5〜8min;用镊子将叶盘夹到灭菌过的滤纸上，吸干残留在叶片上的菌液;将小叶片转移到共培养培养基MS上，在培养基表面附加一层灭过菌的滤纸，将叶片正面向上放在滤纸上，封口膜封皿，为实验组;同时将未经农杆菌侵染的叶盘放入同样的共培养基上作为阴性对照，为对照组，用WT表示。[0043]步骤三:将步骤二的实验组和对照组均放置在暗处于28r的温度条件下共培养2-3天;共培养之后，将转化处理的叶盘浸于MS液体培养基中3〜5min。无菌滤纸吸取残留液，转到选择分化培养基MS+KT+NAA+Kan+Carb上，同时将对照叶盘也进行同样的处理。再于光照培养箱中培养，条件为24°C光照16h。[0044]步骤四：转化后根的再生，转化约6周后，将分化的抗性芽切转入选择生根培养基MS+Kan+Carb上，10〜15d后可见生根。经PCR，QRT-PCR检测，将NtWRKY50过表达和RNAi转基因无菌苗进行大量无性繁殖，生根后转移至泥炭基质中盆栽培养。[0045]实施例四:转基因烟草植株接菌方法[0046]叶片注射接菌:青枯菌CQPS-1来自本实验室从重庆彭水地区分离并于-8rc保存，取青枯菌CQPS-1在NA培养基上划线培养48h，挑选单克隆NB培养过夜至〇D6GGl，稀释菌液至0D=0_01，注射器去掉针头将20ul菌液从背面注射到株龄为8w的烟草植株叶片中；另外，对照组接入等量灭菌ddH20。[OO47]灌根接菌:青枯菌CQPS-1在NA培养基上活化，接种于NB培养基摇菌过夜OD6〇o1，灭菌ddlfeO稀释到0D6k=0.1108CFUmL用于接菌。株龄为8w的烟草植株，围绕茎基部灌入10mL青枯菌菌液；另外，对照组接入等量灭菌ddH20。实验重复三次，SPASS软件版本13•0ttest，P0.05分析差异是否显著。[0048]病情分级如下:0级，全株无病；1级茎部偶有褪绿斑或病侧半数以下叶片或顶部轻度凋萎;2级，茎部有黑色条斑，但未到达植株顶部或病侧半数以上叶片或腰部以上的叶片凋萎;3级，茎部黑色斑达植株顶部或叶片全部凋萎或大部分叶片凋萎;4级，病株全死。[0049]伤根接菌:伤根接菌步骤基本与灌根接菌相同，只是在灌入菌液之前，用小刀在距离茎基部lcm的位置，左右两边垂直划伤根部。接菌3〇1^11、11、31、51后，搜集植株根和茎部，研钵内研磨，稀释成不同梯度，涂于NA培养基上48h后计数检测含菌量。[0050]实施例五:NtWRKY50基因及cDNA序列的鉴定[0051]本发明基于实验室前期的转录组数据，在烟草感染青枯病的过程中，鉴定到一个WRKY类似基因被显著诱导。进行核苷酸BLAST表明预测的WRKY类似基因与NtWRKY50具有100%相似性，因此命名为NtWRKY50，NtWRKY50的表达随着病程发展逐渐升高，第三天上调超过70倍。根据其预测的cDNA序列设计引物，并用QRT-PCR分析其表达模式。为了验证NtWRKY50基因在青枯菌感染下的转录模式，将8w烟龄的云烟87WT植株通过伤根接种浓度为108CFUtn的细菌lOmL。在接菌后1天，没有观察到枯萎症状，但在根内检测到少量的细菌。随着病程发展，细菌浓度显著增加，并且在接菌第3d出现严重枯萎症状，如图3A和图3B所示。另外，在0、1、3和5天分别采集植物的根和茎基部，提取总RNA，通过反转录进一步产生cDNA。QRT-PCR分析显示NtWRKY50基因在1d开始被诱导表达，随时间增加，表达量在5d达到峰值，如图3C所示。以上结果表明在青枯菌侵染期间NtffRKY50基因被持续诱导激活。[0052]根据预测的NtWRKY50cDNA序列设计引物，进行聚合酶链反应扩增该基因。结果表明，NtWRKY50序列为576个碱基对，编码191个氨基酸。NtWRKY50编码的蛋白含有完整的WRKY结构域WRKYGKK以及锌指基序CX4CX23HXH，与典型的WRKYGQK序列相比，其中有一个碱基G被K的取代，如图4所示。NtWRKY50的核苷酸序列为如SEQIDN0.1所示，该NtWRKY50基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0053]WRKY转录因子通常分为WRKYI，WRKYII和WRKYIII三大类。WRKYII类别进一步分为五个亚组，S卩113,1让，11：，111和116。使用1£0八3.1和邻接方法对财¥1^^50进行系统发育分析。结果表明NtWRKY50与拟南芥AtWRKY8和AtWRKY28—起归类为lie亚组，如图5所示。这个亚组在WRKYGQK七肽序列中含有大量的变异，这与图4表示的结果一致。[0054]实施例六:NtWRKY50的过表达对青枯病害的抗性影响[0055]NtWRKY50的亚细胞定位:将NtWRKY50的开放阅读框序列构建到pEGAD载体中，由花椰采花叶病=CaMV35S启动子控制，并与绿色荧光蛋白（GFP基因的c末端融合。在烟草叶片中使用农杆菌诱导的瞬时表达，结果显示与GFP融合的NtWRKY50位于叶片细胞的细胞核，如图6所示。[0056]构建过表达载体，将NtffRKYM置于CaMV35S启动子下游，通过农杆菌介导转化，得到过表达NtWRKY50的转基因烟草植株。在7个独立的转基因系中，NtWRKY50-〇E2株系的NtWRKY50表达水平最高，如图7A所示。烟龄为8w的烟草采用l〇mL浓度为108CFUmL的青枯菌，根接种，结果如图7B所示，NtWRKY5〇-〇E2植株比WT植株发病率降低。根内细菌含量的评估采用的是伤根法接种，结果如图7：所示。结果表明青枯菌在NtWRKY50-0E2中生长受到抑制，显著低于WT植株。[0057]此外，进行组织化学染色，WT植株和NtWRKY50-0E2植株采用叶片注射法接种青枯菌1天后，用lmgmL3,3’-二氨基联苯胺或〇•imgmL硝基蓝四氮唑染色，在25。：的黑暗环境中分别染色24h和6K3,3’-二氨基联苯胺染色的叶子在乳酸:甘油:无水乙醇体积比为1:1:3的混合液中煮沸，然后在无水乙醇中脱色过夜。硝基蓝四氮唑染色的叶子直接在无水乙醇中脱色过夜。之后将叶子浸泡在100%乙醇中室温下保存并成像，结果如图8所示。结果表明，3，3’-二氨基联苯胺和硝基蓝四挫染色显示在NtWRKY5〇-〇E2中R0S的含量更高。因此，这些结果表明NtWRKY50可以正调控烟草对青枯菌的抗性。[0058]为进一步确定NtWRKY50在调节植物病害抗性方面的作用，我们使用反义沉默技术RNAi来干扰NtWRKY50在烟草中的表达。使用QRT-PCR检测7个RNAi株系S1-S7的NtWRKY50的转录水平，如图9A所示。结果表明S2株系中NtWRKY50转录水平最低。与NtWRKY50过表达植物一样，我们用青枯菌接种，检测其抗性。结果表明，NtWRKY50沉默株系S2与WT株系相比，发病症状和细菌生长都无明显差异，如图9B和9C所示。这些结果表明，干扰NtWRKY50表达不会改变烟草抗病性，NtWRKY50与其他转录因子在功能上是冗余的。[0059]实施例七:非生物胁迫对NtWRKY50诱导[0060]为研宄NtWRKY5〇面临各种非生物胁迫的反应，本实施例进行了非生物胁迫处理如下:对烟龄为8w的烟苗叶片喷施浓度为2mM水杨酸SA、0•ImM茉莉酮酸JA、7mM乙烯ETH、100yMABA、0.6mMGA、1OmMIfeO2、2〇OmMNaCl溶液，将盆栽烟苗放入38X：环境中热处理，15°C环境中冷处理，并进行伤害处理，采用刀片将植物叶片平行划出8个伤口，然后分别在不同时间点提取RNA，QRT-PCR检测NtWRKY50的表达量，采用高效液相色谱-质谱法定量分析SA。结果表示，当WT云烟87受到各种激素诱导时，NtWRKY50表达增加，尤其以SA效果最好，在24h到达最高值，较诱导前上升10倍;ETH和JA处理，能够诱导NtWRKY50上升5或则7倍;其他胁迫处理同样诱导NtWRKY50的上调;冷，热以及NaCl处理对NtWRKY50影响较大，峰值可以达到诱导前的4-6倍;H2O2和伤害处理的诱导效果最不明显，最高值仅为对照2倍。综上所述，NtWRKY50响应各种激素或者胁迫诱导，激素的诱导效果较好。[0061]实施例八:植物激素分析[0062]SA、JA和ET是重要的防御信号分子，下面将分析NtWRKY50过表达对SA-、JA-和ET-应答基因表达的影响。[0063]通过伤根接种NtWRKY5〇-0E2和WT植株，提取总RNA，并生成cDNA。用QRT-PCR分析SA和JAET响应的PR基因，如PR1AC、PR1B、PR2、PR3，ET生物合成和信号标记基因，如ACCOxidase、ACSl和EFE26，HR相关基因HSR201和H1N1以及R0S清除酶基因，包括过氧化氢酶CAT，超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽硫-转移酶GST。在青枯菌侵染前，与WT相比，在NtWRKY5〇-〇E2中？1?18、？1?2、八0314?£26的基因表达上调了3-6倍，而？1?3和耵价增加20-30倍，如图10A所示，其他基因没有明显变化。然而，接菌后NtWRKY50-0E2中大多数基因的转录水平比WT上调50-800倍，如图10B所示。但是R0S清除酶表现出不同的调控模式：CAT在NtWRKY50-0E2中表达水平比WT更低，而GST的表达量是WT的10倍。这些研究结果表明，NtWRKY50正调激素介导的防御途径，特别是在受到病原侵染之后。[0064]植物激素，尤其是SA和JA在抵御病害侵染中具有十分重要的作用，为研究NtWRKY50-0E2抗性提高的表型是否与内源激素水平变化相关，我们在青枯菌接菌前后，采用GC-MS对NtWRKY50-0E2和WT植物中SA和JA水平进行了检测。如图11所示，接菌前，在WT植株中检测到少量的SA=3.98ngg，而NtWRKY5〇-〇E2的SA含量为51•59ngg，约为WT植株的13倍。然而，在青枯菌侵染后，SA水平在WT植株中急剧上升到65•Slngg，但在NtWRKY50-0E2中只有轻微上调，两者含量相当。与此不同，WT和NtWRKY5〇-〇E2的JA含量在接菌前相似，分别为3•27ngg和3•30ngg。接菌后，WT中JA水平显著增加到32•34ngg，约上升10倍，但在NtWRKY50-0E2中几乎没有变化。这些结果表明NtWRKY50对SA和JA含量影响不同，NtWRKY50过表达特异性地促进SA积累，但抑制病侵染后的JA表达。[0065]以上结果表明，在没有接菌的情况下，NtWRKY50-0E2的SA和JAET响应的PR基因以及ET合成和信号途径相关基因分别上调3-6或20-30倍，而青枯菌侵染后这些基因的表达水平比WT增加了50-800倍。说明NtffRKY50可以协调激活SA和JAET防御通路。[0066]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

权利要求：1.一种植物抗病基因NtWRKY50,其特征在于，所述NtWRKY50基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种植物抗病基因NtWRKY50，其特征在于，所述NtWRKY50基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.包含如权利要求1所述的一种植物抗病基因NtWRKY50的过表达载体。4.根据权利要求3所述的一种植物抗病基因NtWRKY50的过表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法是采用cDNA作为模板进行NtWRKY50PCR扩增，上游引物加入BglII酶切位点，下游引物加入BstEII酶切位点，并在蛋白末端引入6个HIS蛋白，电泳切胶回收PCR扩增NtWRKY50片段，双酶切后连接到PVCT2024表达载体上，置于CaMV35S启动子下游，得到CaMV35S启动子驱动NtWRKY50基因的过表达载体。5.包含如权利要求1所述的一种植物抗病基因NtWRKY50的RNAi干扰载体。6.根据权利要求5所述的一种植物抗病基因NtWRKY50的RNAi千扰载体的构建方法，其特征在于，所述方法是采用pBWAVHS载体，PCR扩增NtWRKY50的正向靶标、反向靶标和中间的loop，再通过酶切连接反应，插入到CaMV35S启动子下游。7.根据权利要求1所述的一种植物抗病基因NtWRKY50或权利要求3所述的过表达载体在烟草抗青枯病中的应用。

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