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申请/专利权人：西南大学

摘要：本发明公开了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisSwl‑19及其应用，枯草芽孢杆菌Swl‑19由家蚕中肠中分离，芽孢大小为0.8～1.2×1.2～2.4μm，椭圆形柱状，菌落表面干燥粗糙不透明、乳白色，边缘成整齐，能够产生胞外消化酶，如α‑淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等，还能提高家蚕丝叶转化率和健康性，因此可以作为蚕用益生菌，对蚕业生产具有重要作用。

主权项：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Swl‑19，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.10333。

全文数据：蚕用益生枯草芽孢杆菌SwI-19及其应用技术领域[0001]本发明属于生物领域，具体涉及蚕用益生枯草芽孢杆菌（BacillussubtilisSwl-19及其应用。背景技术[0002]益生菌Probiotics是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于宿主肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称，常见的益生菌芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌、光合细菌等。目前，益生菌已被广泛应用于食品、医药保健和饲料等各领域。通过美国食品与药物安全管理局FDA和美国饲料管理会AAFCO认可的可以饲喂的微生物有43种，其中芽孢杆菌有5种，分别是短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus、缓慢芽抱杆菌（BacillusIentus、枯草芽抱杆菌（BacillussubtiIis、凝结芽抱杆菌（Baci11uscoaguIans和地衣芽抱杆菌（Baci11usIicheniformis。我国农业部2006年公布的允许使用的饲料微生物添加剂有16种，其中添加的芽孢杆菌有2种，分别是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。随着国内外研究的深入，更多的芽孢杆菌的益生作用被证实，国内外报道用于畜禽生产中的芽孢杆菌除上述几种外，还有巨大芽抱杆菌BaciIIusmegaterium、环状芽抱杆菌BaciIIuscirculans、东洋芽抱杆菌Bacillustoyoi、坚强芽抱杆菌Bacillusfirmus、錯样芽胞杆菌Bacilluscereus、纳豆芽孢杆菌BaciIlusnatto。家蚕是一种特种经济动物，饲养具有一定的特殊性，其常见的益生菌并不适用于家蚕，因此筛选出来针对家蚕饲养的芽胞杆菌具有潜在的益生功能，以促进蚕业生产。发明内容[0003]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供对蚕业生产有促进作用而且具有益生菌，该菌株可以作为产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶的菌株，为蚕业生产相关的酶制剂带来帮助;本发明的目的之二在于提供枯草芽孢杆菌Swl-19在制备蚕用益生菌中的应用;本发明的目的之三在于提供枯草芽孢杆菌Swl-19在提高家蚕丝叶转化率中的应用。[0004]为实现上述发明目的，经研究，本发明提供如下技术方案：[0005]1、枯草芽孢杆菌BacillussubtilisSwl-19,由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.10333。枯草芽孢杆菌为Swl-19单个细胞1.0〜1.4X3.4〜4.4μπι，颜色均匀、无荚膜、周生鞭毛、能运动并且需氧;芽孢大小为0.7〜0.9X1.2〜2.4μπι，椭圆形柱状;菌落表面干燥粗糙不透明、乳白色，边缘成整齐;可利用蛋白质、多种糖及淀粉，能分解色氨酸形成吲哚。枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖因此而得名;有的枯草芽孢杆菌是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌;有的枯草芽孢杆菌具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作为核苷生产菌的亲株或制取5’-核苷酸酶的菌种。并且枯草芽孢杆菌具有如下作用：1枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；2枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长;3刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力;4枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用。5.能合成维生素BI、Β2、Β6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。[0006]枯草芽孢杆菌不仅在饲料中应用比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛，是一种多功能的微生物。应用范围：1.市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理。2.畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖。3.可以与多种菌种混配，在农业生产中具有重要作用。[0007]2、所述枯草芽孢杆菌Swl-19在作为家蚕益生菌中的应用。[0008]优选的，所述益生菌为产胞外消化酶的益生菌。[0009]优选的，所述胞外消化酶为蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶或和纤维素酶。[0010]3、所述枯草芽孢杆菌Swl-19在提高家蚕丝叶转化率中的应用。[0011]优选的，所述丝叶转化率为上蔟率、结茧率、全茧量或茧层率。[0012]本发明的有益效果在于:本发明公开了枯草芽孢杆菌Swl-19,该菌株是家蚕肠道内的优势菌群，可以产生α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等消化酶类，对家蚕的健康性和桑丝转化率起到促进作用；将其应用到蚕业饲养中能提高家蚕成活率，促进上蔟后家蚕的吐丝量，对蚕业生产有极大的帮助作用。附图说明[0013]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：[0014]图1为枯草芽孢杆菌Swl-19的扫描电镜结果。[0015]图2为枯草芽孢杆菌Swl-1916SrDNA序列PCR电泳图（M:NMW012;Swl-19:16SrDNA序列PCR扩增结果）。[0016]图3为基于16SrDNA序列的N-J法系统发育分析Bacilluscirculars:环状芽胞杆菌;BaciIlusfirmus:强固芽胞杆菌;BaciIlusazotoformans:产氮芽胞杆菌;BaciIlusIentus:迟缓芽胞杆菌；Bacillusfastidiosus：afIfIMI；BaciIlusmegaterium:巨大芽胞杆菌；Virgibacilluspantothenticus:泛酸枝芽胞杆菌；Bacillusglobisporus:娃酸盐矿物分解细菌;BaciIluspasteurii:巴氏芽孢杆菌;BacillusalcalophiIus:嗜碱芽胞杆菌;BacilluspumiIus:短小芽抱杆菌;BacillusIicheniformis:地衣芽抱杆菌；PaenibaciIIuspopi11iae:乳白色致病细菌;PaenibaciIIusIentimorbus:泛酸枝芽胞杆菌;Bacillusamyloliquefaciens:解淀粉芽抱杆菌;Bacillustequilensis:特基拉芽抱杆菌；Bacillussubtilisstrain:枯草芽抱杆菌菌株;Bacilluscoagulans:凝结芽抱杆菌;GeobaciIlusstearothermophilus:嗜热脂肪地芽抱杆菌;BaciIlusmycoides:蕈状芽抱杆菌；BaciIIusanthracis:炭疽杆菌；Bacilluscereus:錯样芽抱杆菌；BaciIIusthuringiensis:苏云金芽胞杆菌）。[0017]图4为菌株Swl-19的溶血性试验结果。[0018]图5为菌株Swl-19在筛选培养基上形成的水解圈A:产蛋白酶菌株在筛选培养基上形成的水解圈；B:产脂肪酶菌株在筛选培养基上形成的水解圈；C:产纤维素酶菌株在筛选培养基上形成的水解圈;D产淀粉酶菌株在筛选培养基上形成的水解圈）。[0019]图6为菌株Swl-19产胞外消化酶能力。[0020]图7为添食菌株Swl-19后家蚕肠道菌群的DGGE图谱。[0021]菌种保藏[0022]本发明中枯草芽孢杆菌BacillussubtilisSwl-19是从家蚕中肠分离获得，送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC保藏，保藏编号为CGMCCNo.10333,地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学微生物研究所，保藏日期为2015年1月9日，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。具体实施方式[0023]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0024]本发明使用的培养基配方如下：[0025]NA固体培养基：牛肉膏5.Og;蛋白胨10.Og;氯化钠5.Og;琼脂15.Og;无菌水IOOOmL;pH中性7.0-7.2。[0026]NB固体培养基：牛肉膏5.Og;蛋白胨10.Og;氯化钠5.Og;无菌水IOOOmL;pH中性7.0-7.2。[0027]实施例1、蚕用益生枯草芽孢杆菌BacillussubtilisSwl-19的筛选与鉴定[0028]1、蚕用益生枯草芽孢杆菌B.subtilisSwl-19的筛选[0029]根据国家农业部公布的可应用于益生菌的菌株筛选范围进行筛选，结合家蚕具体情况最后定为芽孢杆菌，筛选的具体方法为:将蚕种按常规方法催青后饲养至5龄3天，饥饿24h后取50头家蚕用75%的酒精体表消毒，并在酒精灯下轻轻灼烧。无菌条件下解剖家蚕，取中肠及内容物约5g加入到含45mL无菌水的三角瓶中90°C加热15min。吸取加热后的溶液作梯度稀释，稀释度为HT1、KT2、HT3、KT4、KT5、HT6和1〇Λ分别取0.ImL均匀涂布在NA培养基平板上，37°C培养48h。挑选形态有差异的菌落进一步划线分离纯化，直至镜检为单一菌种后于-20°C冰箱保存备用。然后将分离的菌株进行扫描电镜，结果如图1所示。结果显示，分离菌株的大小为I.〇〜1.4X3.4〜4.4μηι，芽孢大小为0.8〜1.2X1.2〜2.4μηι，呈椭圆形柱状，菌落表面干燥粗糙不透明、乳白色，边缘成整齐。[0030]2、蚕用益生枯草芽孢杆菌B.subtilisSwl-19的鉴定[0031]对分离获得的菌株进行形态学、生理生化鉴定具体方法参考《常见细菌系统鉴定手册》和《微生物学实验》等书和分子生物学鉴定，即16SrDNA序列鉴定该菌株的种属，具体方法如下：用细菌通用引物27F和1492R扩增16S核糖体序列，引物27F的序列为5-agagtttgatcctggctcag-3，引物1492R的序列为S'-ggctaccttgitacgactt-g，扩增条件为:50yL扩增体系TaKaRaTaq套装R001B，宝生物工程大连有限公司）：4yLDNA模板，正向和反向引物（lOmolL各lyL，10XPCRbufferMg2+Plus5yL，dNTPMixture各2.5mM4μL，TaqDNA聚合酶5UyL0.3yL，灭菌超纯水补足至50yL;扩增程序为:94°C预变性5min，94。:变性4〇8,55°：退火4〇8,72°：延伸11^11，35个循环，72°：延伸1〇1^11;4°：保存，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。[0032]然后将扩增产物连接到pMD19-TVector上，转化DH5a感受态细胞，然后挑取阳性克隆并测序，结果如SEQIDNO.1所示。将测序获得的16SrDNA序列提交NCBIhttp:www.ncbi.nlm.nih.gov进行BLAST比对并对其同源序列用MEGA5.05软件N-J法构建系统发育树。BLAST比对结果显示获得菌株的16SrDNA与BacillussubtilisstrainYQH60有99%的同源性；系统发育树如图3所示，结果表明获得菌株与枯草芽孢杆菌BaciIlussubtilis聚为一类，这说明该菌株与枯草芽孢杆菌的遗传距离较近。结合菌株的形态特征、生理生化特性，并参照《常见细菌系统鉴定手册》将其命名为枯草芽孢杆菌B.subtilisSwl_19,简称为Swl_19。[0033]选用14种常见抗生素采用K-B法对枯草芽孢杆菌Swl-19进行抗生素药敏检测，同时进行生理生化检测，以确定其药物敏感性和生理生化特性表1。抗生素药敏检测具体方法为:将活化16h后的枯草芽孢杆菌Swl-19取IOOyL均匀涂布在NA培养基表面，在培养基表面均匀放置药敏纸片药敏试纸购自杭州微生物试剂有限公司），检查产酶菌对抗生素的耐药性。[0034]表1、菌株Swl-19的生理生化和抗生素检测[0035][0036]+:阳性；一：阴性+!Positivereaction;—!Negativereaction;S:敏感；M:中等；R:抗性S:sensitive;M:middle;R:resistant[0037]利用哥伦比亚血琼脂平板培养基检测Swl-19的溶血致病性，具体实施步骤:将活化培养的菌株Swl-19点种在血平板上血平板购自江门市凯林贸易有限公司），48h之后观察是否有溶血圈，结果如图4所示。结果显示，菌株Swl-19无溶血性无溶血圈产生），说明其对家蚕不具有致病性。[0038]用产蛋白酶筛选培养基、淀粉酶筛选培养基、脂肪酶筛选培养基和纤维素酶筛选培养基检测SW-19的胞外产消化酶能力，结果如图5和图6所示。结果显示，Swl-19能够产胞外蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等胞外消化酶，且产胞外淀粉酶和纤维素酶能力最强，而产胞外脂肪酶能力相对较弱。上述检测中，产蛋白酶菌株的筛选培养基是在NA培养基中添加酪蛋白至质量百分比为1.0%，pH9.2〜9.8;产淀粉酶筛选培养基是在NA培养基中添加可溶性淀粉至质量分数为1%，pH为9.2〜9.8;产脂肪酶筛选培养基是在NA培养基中添加橄榄油乳化液至浓度为120mLL和终浓度为0.005wt%中性红，pH7.2，橄榄油乳化液的配制方法为:取橄榄油与0.02gmL的聚乙烯醇PVA以体积比1:3的比例混合，10000rmin搅拌乳化5min，得橄榄油乳化液;产纤维素酶筛选培养基是在NA培养基中添加羧甲基纤维素CMC至质量分数为1%，pH为9.2〜9.8。[0039]实施例2、蚕用益生枯草芽孢杆菌BacillussubtilisSwl-19的应用[0040]对家蚕添食蚕用益生枯草芽孢杆菌BacillussubtilisSwl-19后，用DGGE分子技术方法检测该株菌在家蚕体内的定植情况以及对肠道内优势菌群多样性的影响，并调查添食Swl-19后家蚕的丝叶转化率和健康性。其方法采用人工喷洒添食法，对5龄期家蚕体外添食，以检测该菌对家蚕的益生效果，具体步骤如下：[0041]将家蚕正常催青、收蚁后，用新鲜桑叶饲养至4龄期，然后将4龄期蚕第一天分为2个组，每组分3区。试验组家蚕喂食含Swl-19菌株喷洒的桑叶菌液浓度为107cfumL，对照组的家蚕分别喂食清水喷洒桑叶，采用均匀喷洒方式，以确定试验准确性。将2组家蚕饲喂至5龄第3天，取家蚕血液和中肠及其内容物，并将每区定家蚕头数继续饲喂至上蔟。最后用变性梯度凝胶电泳技术检测菌株Swl-19在家蚕肠道内的定植情况以及对家蚕肠道微环境的影响作用，结果如图7所示。将DGGE条带与NCBI数据库对比，结果如表2所示。[0042]表2、DGGE条带与NCBI数据库对比结果[0043][0044]由图7和表2可知，添食菌株Swl-19后家蚕肠道内的优势菌群发生了改变，添食后肠道内的芽孢杆菌属细菌与肠杆菌属细菌明显增加。这些增加的优势菌群会对家蚕的生长以及对营养物质的消化吸收起到促进作用。[0045]按照上述相同的方法饲养家蚕，并采用称重法和计数法调查家蚕的上蔟率、结茧率、健康性、以及全茧量和茧层率，数据采用专业统计学分析软件SPSS20分析，并对各个指标做差异性显著分析，结果如表3所示。[0046]表3、项目调查表[0047][0048]由表3可知，菌株Swl-19在蚕业生产中能够提高丝叶转化率，提高家蚕抗病能力以及结茧率等。[0049]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

权利要求：1.枯草芽孢杆菌BacihussubtiJisSwl-19,由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.10333。2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌Swl-19在制备家蚕益生菌制剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述益生菌为产胞外消化酶的益生菌。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述胞外消化酶为蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶或和纤维素酶。5.权利要求1所述枯草芽孢杆菌Swl-19在提高家蚕丝叶转化率中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述丝叶转化率为上蔟率、结茧率、全茧量或茧层率。

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