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申请/专利权人：云南农业大学

摘要：一种OsSUT3基因高量表达水稻种质筛选的PCR方法，包括待测水稻种质提取总DNA，用引物SUT3‑5’utrF和SUT3‑5’utrR扩增，扩增产物用2.5％的琼脂糖凝胶，溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照；待测水稻种质的PCR扩增产物为743bp条带，则该水稻种质为OsSUT3基因高量表达的水稻种质；待测水稻种质的PCR扩增产物为712bp条带，则该水稻种质为OsSUT3基因低量表达的水稻种质。本发明在水稻生长发育的任何一个时期，使用微量DNA样品就可准确快速鉴别水稻种质材料OsSUT3基因表达量的高低，首次开发出与水稻蔗糖转运基因OsSUT3表达量密切相关的InDel标记。

主权项：1.一种筛选OsSUT3基因高量表达水稻种质的特异性引物SUT3‑5’utr，其特征在于，所述特异性引物SUT3‑5’utr由引物SUT3‑5’utrF和引物SUT3‑5’utrR组成，引物SUT3‑5’utrF的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，引物SUT3‑5’utrR的碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

全文数据：一种OsSUT3基因高量表达水稻种质筛选的PCR方法技术领域本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及筛选水稻蔗糖转运蛋白的编码基因OsSUT3高量表达量的水稻种质的InDel分子标记和PCR方法。背景技术高等植物体内有机物的运输流与光合作用源及光合产物的贮藏库同等重要，是植物体生长和发育的基础。蔗糖作为光合同化产物中最重要的二糖，是合成淀粉的基本原料，同时也是植物体内光合作用产物的主要运输形式ZimmermannandZiegler,1975；Ohshimaetal.,1990；Rosaetal.,2009。蔗糖在韧皮部的装载和卸载都需要借助跨膜蛋白来穿越维管束鞘细胞或韧皮薄壁细胞，执行蔗糖跨膜运输的蛋白主要有SWEET糖转运蛋白Braun,2012；Chenetal.,2012；Eometal.,2015，蔗糖转运蛋白sucrosetransportersorcarriers,SUTsorSUCsAokietal.,2003；Sauer,2007等。蔗糖转运蛋白SUTs通过蔗糖H+的同向协同运输完成蔗糖在植物体内的转运。此外，SUTs是协调植物蔗糖、碳素分配的重要蛋白分子，在植物各个生长阶段的能量分配中起至关重要的作用Wangetal.,2015。编码此蛋白的SUTs基因是一个大的家族，每一种植物中都存在一系列的SUTs基因，这些SUTs基因之间相互协作的同时也存在相互抑制，共同协调植物的生理代谢和生长发育Limaetal.,2010。水稻是我国重要的粮食作物，不断提高其产量一直是我国农业生产中需要解决的重要问题。对于水稻来说，蔗糖的转运和分配是决定产量高低和品质好坏的重要因素。水稻的蔗糖转运蛋白分别由5个SUTs基因构成一个基因家族编码，是水稻转运蔗糖的关键基因，其高量表达将大大提升蔗糖运输效率，从而促进水稻产量的增长。OsSUT3是OsSUTs基因家族中的重要成员，不仅协调水稻中蔗糖的转运，还影响花粉的发育和花粉成熟过程中淀粉的合成Hiroseetal.,2010。因此，水稻植株中OsSUT3基因的高表达有利于水稻的碳水化合物的转运和花粉的正常发育，为水稻高产奠定基础。因而构建一种准确、快速筛选OsSUT3基因高表达的水稻种质的的方法是很有必要的。水稻分子生物学研究及PCR分子标记技术的发展为建立OsSUT3基因高量表达的水稻种质准确快速筛选的方法奠定了可靠理论和技术基础。本发明基于我们对OsSUT3基因表达调控因子的研究，发现一个位于OsSUT3基因上游可调控OsSUT3基因表达量的顺式增强因子，该增强因子正好位于一个的InDel序列上，该InDel序列片段可通过PCR扩增获得。因此，我们通过NCBIhttps:www.ncbi.nlm.nih.gov水稻基因组数据库，查找OsSUT3基因起始密码子ATG上游1000bp和下游500bp的碱基序列，共1500bp；用引物设计软件Primer5.0设计包含OsSUT3基因上游序列的特异性引物SUT3-5’utr。然后利用PCR技术对该InDel标记扩增，就可准确快速鉴别水稻种质材料的OsSUT3基因表达量的高低。参考文献Zimmermann,M,Ziegler,H.Listofsugarsandsugaralcoholsinsieve-tubeexudates.In:Zimmermann,M.,Milburn,H.Eds.,EncyclopediaofPlantPhysiology,NS,vol.1.Springer,NewYork.1975:480-503.Ohshima,T,Hayashi,H,Chino,M.CollectionandchemicalcompositionofpurephloemsapfromZeamaysL.PlantCellPhysiol.1990,31:735-737.RosaM.,PradoC.,PodazzaG.,etal.Solublesugars--metabolism,sensingandabioticstress:acomplexnetworkinthelifeofplants.PlantSignalBehav.2009,45:388-393BraunDM.SWEET！Thepathwayiscomplete.Science.2012,335:173-174.ChenLQ,QuXQ,HouBHetal.SucroseeffluxmediatedbySWEETproteinsasakeystepforphloemtransport.Science.2012,3356065:207-211.EomJS,ChenLQ,SossoDetal.SWEETs,transportersforintracellularandintercellularsugartranslocation.CurrOpinPlantBiol.2015,25:53-62.AokiN.,HiroseT.,ScofieldG.N.,etal.Thesucrosetransportergenefamilyinrice.PlantandCellPhysiology.2003.443:223-232.SauerN.Molecularphysiologyofhigherplantsucrosetransporters.FEBSLett.2007,58112:2309-2317.WangL,LuQ,WenXetal.EnhancedSucroseLoadingImprovesRiceYieldbyIncreasingGrainSize.PlantPhysiol.2015,1694:2848-2862.LimaJ.D.,ChobJ.,ParkcY.,etal.Sucrosetransportfromsourcetosinkseedsinrice.PhysiologiaPlantarum.2010,1264:572-584.Hirose,T.,Zhang,Z.,Miyao,A.,Hirochika,H.,Ohsugi,R.,Terao,T.2010,Disruptionofageneforricesucrosetransporter,OsSUT1,impairspollenfunctionbutpollenmaturationisunaffected,JExpBot.,61,3639-46.发明内容本发明提供一种操作简单、样品用量少，而且水稻生长发育的任何时期都能够快速准确鉴别水稻种质材料OsSUT3基因表达量高低PCR方法及其特异性引物。通过此方法，可准确筛选蔗糖转运效率高的水稻种质，对促进水稻高产育种，提高产量和品质具有重要意义。本发明提供的一种筛选OsSUT3基因高量表达水稻种质的特异性引物SUT3-5’utr，由引物SUT3-5’utrF和引物SUT3-5’utrR组成，引物SUT3-5’utrF的碱基序列如SEQIDNO:1所示，引物SUT3-5’utrR的碱基序列如SEQIDNO:2所示。本发明提供的一种OsSUT3基因高量表达水稻种质筛选的PCR方法，包括以下步骤：1提取待测水稻种质的总DNA；2用上述的特异性引物SUT3-5’utr在PCR仪中进行DNA目标片段的扩增；3PCR扩增完成后，取5μL扩增产物，采用2.5％的琼脂糖凝胶，在电压60V电泳2小时后溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下拍照；4待测水稻种质的PCR扩增产物为743bp条带，则表明该水稻种质为OsSUT3基因高量表达的水稻种质；待测水稻种质的PCR扩增产物为712bp条带，则表明该水稻种质为OsSUT3基因低量表达的水稻种质图1。与现有技术相比，本发明的主要创新点和有益效果是：在水稻生长发育的任何一个时期，通过常规PCR技术，使用微量DNA样品就可准确快速鉴别水稻种质材料OsSUT3基因表达量的高低，免除现在通用的荧光实时定量PCR测定基因表达的方法所具有的许多限制，比如现在通用的荧光实时定量PCR方法要在特定生育时期基因表达高峰取样、提取RNA等既耗时又耗材的工作。首次开发出与水稻蔗糖转运基因OsSUT3表达量密切相关的InDel标记特异性引物SUT3-5’utr，为水稻分子育种提供便捷途径。在水稻高产、优质米育种过程中，可在水稻生长发育的各个时期从水稻的遗传物质DNA本身就可大排量筛选OsSUT3基因表达量高水稻材料，不需等到水稻OsSUT3基因表达量较高的灌浆期，可极大地缩短筛选高OsSUT3基因表达量种质的时间，也可极大减少种质筛选的工作量，具有操作简单、准确、快速等优点。序列表中SEQIDNO:1所示的是引物SUT3-5’utrF的碱基序列。序列表中SEQIDNO:2所示的是引物SUT3-5’utrR的碱基序列。附图说明图1：水稻品种中特异性引物OsSUT3-5’utr的PCR扩增产物及其OsSUT3基因表达量的检测。M为DNA分子量标准。泳道1-4表示不同的水稻，1：93-11、2：日本晴、3：牛八谷、4：大香谷，泳道1-2和3-4的PCR片段的分子量分别为743bp和712bp，其上方是对应品种的OsSUT3基因的相对表达量及具有743bp和712bp片段的品种的表达量的差异倍数。水稻品种的OsSUT3基因表达量的测定通过提取水稻开花前的叶片总RNA用PremixEXTaqTMⅡTliRNaseHPluskitTakara,Dalian,China试剂盒，通过荧光定量PCRqRT-PCR方法检测，每个品种进行3个生物学重复测定。图2：不同水稻材料OsSUT3表达量高低的PCR鉴定。特异性引物OsSUT3-5’utrPCR扩增产物的电泳检测结果，M为DNA分子量标准。泳道1-3,5-7,9-11水稻种质的PCR扩增片段的分子量为743bp，说明这几个水稻种质为OsSUT3基因高量表达的水稻种质；第4和第8泳道的PCR扩增产物分子量为712bp，说明两个水稻种质为OsSUT3基因低量表达的水稻种质。泳道1-11为不同的水稻，1：93-11；2：日本晴；3：六月谷；4：大香谷；5：攀农1号；6：永宁小白谷；7：阿楚车；8：牛八谷；9：八宝谷；10：冷水谷；11：大蚂蚱谷。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。一、试验所用材料表1供试水稻品种表1中所有供试材料可由本专利申请人云南农业大学从申请日起二十年内向公众发放，云南农业大学地址：云南省昆明市盘龙区沣源路452号，邮编：650201。1.93-11公开文献：ZhangGHetal.,LSCHL4fromJaponicaCultivar,whichisallelictoNAL1,increasesyieldofindicasuperrice93-11,MolecularPlant,2014,78,1350-1364.2.日本晴公开文献：DengYetal.,DetectionandcorrectionofassemblyerrorsofriceNipponbarereferencesequence,PlantBiolStuttg,2014,163,643-650.3.六月谷公开文献：李明启等，野生稻和栽培稻的光合作用和叶绿素含量的比较研究，植物生理学报,1984,4,333-338.4.大香谷、冷水谷、大蚂蚱谷公开文献：寇姝燕等，中国西双版纳水稻老品种在育性恢复基因Rf-1位点的遗传多样性，分子植物育种,2009,74,653-660.5.攀农1号公开文献：李松等，水稻抗寒性鉴定及其生理指标测定，云南大学学报自然科学版,1990,3,65.6.永宁小白谷、阿楚车、牛八谷公开文献：谭亚玲等，海拔高度对不同水稻品种生长的影响研究，种子,2009,287,27-30.7.八宝谷公开文献：孙雁等，候选抗病基因在水稻品种多样性研究中的应用，中国农业科学,2005,3811,2227-2232.二、供试水稻品种的总DNA提取采用改良的CTAB法RogersandBendich,1985从新鲜的水稻苗四叶期中提取总DNA。方法如下：1取约0.5g四叶期水稻材料放入到1.5mL离心管中，加入液氮冷冻研磨，在磨碎后的粉末中加入2×CTAB缓冲液600μL，放入65℃水浴锅中45min，每隔15min混匀一次。2取出离心管加入等体积的苯酚氯仿异戊醇体积比为25:24:1，颠倒混匀后10000rpm离心10min。3用去尖的枪头小心移出上层水相液体至1.5mL新离心管中，加入600μL苯酚氯仿异戊醇体积比为25:24:1，颠倒混匀后10000rpm，10min。4小心转移上层水相至新的离心管中，加入2-3倍体积冰预冷的无水乙醇和110体积的3MNaAC醋酸钠pH5.2，将离心管置于-20℃冰箱中冰冻10-20min，直至有絮状沉淀产生。5用灭菌的牙签挑出絮状沉淀，并用70％乙醇洗涤2次，用灭菌的滤纸吸去乙醇并自然晾干，使乙醇充分挥发。6加入100μl的TE溶液溶解DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测后置于-20℃保存备用。三、PCR扩增用PCR引物SUT3-5’utrF和引物SUT3-5’utrR对11个水稻材料表1叶片的DNA样品进行PCR扩增，其反应体系总体积为15μL，其中TaqPCRMasterMix7.5μLTaKaRa，10pmolL引物SUT3-5’utrF1.5μL，10pmolL引物SUT3-5’utrR1.5μL，模板DNA2μL，无菌双蒸水2.5μL；按照上述配制完成PCR反应后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入EppendorfPCR仪中，设置反应程序进行如下反应：94℃预变性4min，循环内94℃变性40s，60℃退火1min，72℃复性1min，35个循环后72℃延伸10min，每次可同时检测96个样品，所述引物SUT3-5’utrF的碱基序列如SEQIDNO:1所示，引物SUT3-5’utrR的碱基序列如SEQIDNO:2所示。四、电泳检测待上述以11个水稻品种叶片DNA为模板的PCR反应完成后，各取5μL的PCR扩增产物，采用2.5％的琼脂糖凝胶，在电压60V电泳2小时后溴化乙锭EB染色，在凝胶成像系统下拍照。供试水稻材料的PCR产物的电泳结果如图2。结果可见，泳道1-3，5-7，9-11的品种的扩增分子量较大，为743bp；而泳道4和8的扩增条带分子量较小，为712bp。结合图1，泳道1-3，5-7，和9-11的供试品种为OsSUT3基因高量表达的水稻种质，而泳道4和8的两个品种为OsSUT3基因低量表达的水稻种质。序列表云南农业大学一种OsSUT3基因高量表达水稻种质筛选的PCR方法2SIPOSequenceListing1.0119DNA人工序列ArtificialSequence1cacaatgtctcaccgctcc19221DNA人工序列ArtificialSequence2caggcagcataagaggaaatc21

权利要求：1.一种筛选OsSUT3基因高量表达水稻种质的特异性引物SUT3-5’utr，其特征在于，所述特异性引物SUT3-5’utr由引物SUT3-5’utrF和引物SUT3-5’utrR组成，引物SUT3-5’utrF的碱基序列如SEQIDNO:1所示，引物SUT3-5’utrR的碱基序列如SEQIDNO:2所示。2.一种OsSUT3基因高量表达水稻种质筛选的PCR方法，包括以下步骤：1提取待测水稻种质的总DNA；2用权利要求1所述的特异性引物SUT3-5’utr在PCR仪中进行DNA目标片段的扩增；3PCR扩增完成后，取5μL扩增产物，采用2.5％的琼脂糖凝胶，在电压60V电泳2小时后溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下拍照；4待测水稻种质的PCR扩增产物为743bp条带，则表明该水稻种质为OsSUT3基因高量表达的水稻种质；待测水稻种质的PCR扩增产物为712bp条带，则表明该水稻种质为OsSUT3基因低量表达的水稻种质。

百度查询： 云南农业大学 一种OsSUT3基因高量表达水稻种质筛选的PCR方法