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申请/专利权人：中国科学院水生生物研究所

摘要：本发明公开了一种小球藻Chlorella zofingiensis异养高密度培养方法，所述培养方法是将小球藻Chlorella zofingiensis接种到发酵罐中培养，使用的基础培养基和补料培养基均以铵盐为氮源；基础培养基中碳氮比为5:1‑80:1，补料培养基中碳氮比是基础培养基中碳氮比的5‑20倍；培养过程中实时监测培养体系的pH值，根据监测结果用补加氨水的方式调节培养体系pH值保持在6.5±0.2并作为氮源补充；培养过程中实时监测培养体系的葡萄糖浓度，当基础培养基中葡萄糖浓度降至3‑4 gL时开始流加补料培养基，且流加速度使任两小时内培养体系中葡萄糖的浓度变化幅度小于20%。本发明根据细胞在利用铵盐过程中造成pH下降的特性，借用氨水调控pH并同时作为氮源补充。本发明可有效避免现有固定碳氮比流加培养模式下氮源过量或匮乏对细胞生长的抑制作用。

主权项：1.一种小球藻Chlorella zofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：所述培养方法是将小球藻Chlorella zofingiensis接种到发酵罐中培养，培养过程中使用的基础培养基和补料培养基均以铵盐为氮源，以葡萄糖为碳源；其中，基础培养基中碳氮质量比为5:1‑80:1，而补料培养基中碳氮比为基础培养基中碳氮比的5‑20倍；在培养过程中，实时监测培养体系的pH值，根据pH值的监测结果，用补加氨水的方式调节培养体系的pH值在6.5±0.2并同时作为氮源补充；在培养过程中，实时监测培养体系的葡萄糖浓度，当基础培养基中的葡萄糖浓度将至3‑4 gL时开始流加补料培养基，且流加补料培养基的速度满足使每两小时内培养体系中葡萄糖的浓度变化幅度小于20%的要求。

全文数据：一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法技术领域本发明涉及微藻培养技术领域，具体涉及一种小球藻异养高密度培养方法。背景技术虾青素是一种紫红色酮式类胡萝卜素，具有超强的着色和抗氧化功能，在水产养殖、食品、医药、化妆品等领域有着广泛的应用。小球藻Chlorellazofingiensis属单细胞绿藻，它生长速度快并能高效积累虾青素，被认为是继雨生红球藻和红发夫酵母之后又一备受关注的天然虾青素生产来源[文献1：IPPF,ChenF.PeroxynitriteandnitrylchlorideenhanceastaxanthinproductionbythegreenmicroalgaChlorellazofingiensisinheterotrophicculture.ProcessBiochemistry,2005,40:3595-3599]。作为工业虾青素生产的新型潜在微藻，小球藻Chlorellazofingiensis不仅能够利用光能和CO2进行自养生长，也可以利用有机碳源进行异养培养。相对于光自养培养而言，微藻异养培养因其细胞高密度、培养周期短、工艺参数易控制等优势而备受关注。微藻异养培养过程中，氮源种类以及培养过程中碳氮比的供应对微藻细胞生长至关重要。研究表明，尿素、硝态氮（硝酸钠或硝酸钾）和铵态氮（氯化铵或硫酸铵）是微藻培养过程中最常用的几类氮源[文献2：Morales-SánchezD,Tinoco-ValenciaR,Caro-BermúdezMA,etal.CulturingNeochlorisoleoabundansmicroalgainanitrogen-limited,heterotrophicfed-batchsystemtoenhancelipidandcarbohydrateaccumulation.AlgalResearch,2014,5:61-69.；文献3：GraverholtOS,EriksenNT.Heterotrophichigh-cell-densityfed-batchandcontinuous-flowculturesofGaldieriasulphurariaandproductionofphycocyanin.ApplMicrobiolBiotechnol,2007,77:69-75.；文献4：[4]LiuJ,HuangJC,FanKW,etal.ProductionpotentialofChlorellazofingienesisasafeedstockforbiodiesel.BioresourceTechnology,2010,101:8658-8663.]。目前，小球藻Chlorellazofingiensis的异养培养主要采用硝态氮源和固定的碳氮比，微藻吸收利用硝态氮过程要消耗大量的能量、碳和质子，藻细胞生长速度较慢；而培养基固定碳氮比培养会造成培养过程中氮的缺乏或逐渐积累，均对细胞生长产生不利影响，导致藻细胞浓度不高[文献5：ZhangZ,HuangJJ,SunDZ,etal.Two-stepcultivationforproductionofastaxanthininChlorellazofingiensisusingapatentedenergy-freerotatingfloatingphotobioreactorRFP.BioresourceTechnology2017,224:515-522.；文献6：LiuJ,HuangJC,SunZ,etal.DifferentiallipidandfattyacidprofilesofphotoautotrophicandheterotrophicChlorellazofingiensis:Assessmentofalgaloilsforbiodieselproduction.BioresourceTechnology2011,102:106-110.；文献7：SunN,WangY,LiYT,etal.Sugar-basedgrowth,astaxanthinaccumulationandcarotenogenictranscriptionofheterotrophicChlorellazofingiensisChlorophyta.ProcessBiochemistry2008,43:1288-1292.]。目前异养培养小球藻Chlorellazofingiensis最常用的培养基是CZ-M1培养基或在此基础上改良的培养基[文献8：NiSun,YanWang,Yan-TaoLi,etal.Sugar-basedgrowth,astaxanthinaccumulationandcarotenogenictranscriptionofheterotrophicChlorellazofingiensisChlorophyta.ProcessBiochemistry2008,43:1288–1292.]，文献8采用的正是这种培养基，它以葡萄糖和硝酸钠作为碳源和氮源，发酵过程中采用脉冲式补料方式流加葡萄糖，当培养过程中葡萄糖浓度低于5gL-1时，流加浓缩补料培养基，使发酵过程中葡萄糖浓度维持在5-20gL范围内。该文献中采用吸收利用能量需求较高的硝态氮源，并且该培养模式整个培养过程采用固定的碳氮比（补料中的碳氮比恒定、且与基础培养基中碳氮比一致），微藻细胞生长缓慢且细胞生物量浓度较低，培养15天细胞浓度仅为53gL。氮是微藻生长必需的关键营养元素之一，微藻吸收利用硝态氮过程需要消耗大量的能量、碳和质子。目前，已报道的小球藻Chlorellazofingiensis异养培养过程均采用高耗能硝态氮如硝酸钠，细胞对氮素营养的利用较慢。另外，包括小球藻Chlorellazofingiensis在内的大多数微藻在培养过程中均是以碳的消耗情况作为补料指标，并以固定碳氮比进行补料，未考察细胞对氮的实际利用情况，细胞在不同生长期及不同生理状态下对氮营养的需求不同，在碳和氮的吸收利用不匹配时，固定的碳氮比补料必然会导致碳源营养的匮乏或逐渐大量积累，最终影响细胞的正常生长速度和生物量浓度。综上，本领域仍然需要一种更实用、更高效的小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，为利用小球藻Chlorellazofingiensis及其突变体高效生产虾青素及其它高附加值色素提供技术支撑。发明内容为了解决现有小球藻Chlorellazofingiensis高密度培养过程使用硝态氮和固定碳氮比下细胞增殖速度慢、生物量浓度低的问题，本发明提供一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，利用吸收利用过程能耗较低的铵盐作为氮源，同时摒弃了传统的固定碳氮比供料，改为根据小球藻在利用氮源的过程中造成pH下降的情况，适应性地补充氨水，在补充氨水过程中一方面通过补充氨水使微藻异养环境维持恰当且较恒定的pH，另一方面氨水也作为氮源的补充提供给藻细胞生长利用，因而氨水所提供的氮源实际上是根据微藻细胞对氮的利用情况和需求自适应地补充的，由此避免因固定碳氮比补料给微藻生长带来的限制，达到提高细胞的生长速度和生物量浓度的目的，为小球藻Chlorellazofingiensis及其突变株的异养高密度培养提供技术支撑。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，所述培养方法是将小球藻Chlorellazofingiensis接种到发酵罐中培养，培养过程中使用的基础培养基和补料培养基均以铵盐为氮源，以葡萄糖为碳源；其中，基础培养基中碳氮质量比为5:1-80:1，而补料培养基中碳氮质量比为基础培养基中碳氮比的5-20倍；在培养过程中，实时监测培养体系的pH值，用补加氨水的方式调节培养体系的pH值在6.5±0.2并同时作为氮源补充；在培养过程中，实时监测培养体系的葡萄糖浓度，当基础培养基中的葡萄糖浓度降至3-4gL时开始流加补料培养基，且流加补料培养基的速度满足使每两小时内培养体系中葡萄糖的浓度变化幅度小于20%的要求。优选地，基础培养基中碳氮质量比为10:1-40:1，而补料培养基中碳氮质量比为基础培养基中碳氮比的10-15倍。在本发明一个较佳实施例中，其中，所述流加补料培养基的速度满足使培养体系中葡萄糖的浓度保持在5gL±40%。在本发明一个较佳实施例中，其中，所述基础培养基中葡萄糖的初始浓度为20gL。在本发明一个较佳实施例中，其中，所述异养培养的温度为27-29℃，通风比为1:1-1:0.5，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为20%，且培养过程中用添加氨水的方式调节pH为6.5-7，优选的pH为6.5。在本发明一个较佳实施例中，其中，所述铵盐为氯化铵。在本发明一个较佳实施例中，其中，在培养过程中，由计算机根据培养体系的实时监测结果，控制速度可调的蠕动泵流加补料培养基和氨水，以控制培养体系的pH和葡萄糖浓度。在本发明一个较佳实施例中，其中，在接种到发酵罐之前，还包括藻种活化和三级种子扩培得到种子液的过程，即：（1）藻种活化：将藻种接种在平板上培养至形成菌落，在无菌环境下，用接种环从已培养好的平板上挑取小球藻Chlorellazofingiensis单菌落，于灭菌平板上进行划线，将划线后的平板置于无光照环境下进行培养，培养温度25℃，培养时间15-20天，形成明显的小球藻Chlorellazofingiensis藻单菌落；（2）一级种子培养：从步骤（1）活化处理后的平板上，挑取一环小球藻Chlorellazofingiensis（Φ2~3mm）于15~30mL培养基中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpmmin，培养120-144h，使OD750=8，得到一级种子液；（3）二级种子培养：将培养好的一级种子液以10%（vv）接种量接种于100~200mL培养基中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpmmin，培养72~84h，使OD750=16-20，得到二级种子液；（4）三级种子培养：将培养好的二级种子液以10%（vv）接种量接种于300~600mL培养基中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpmmin，培养72-84h，使OD750=20-22，得到三级种子液，所述三级种子液作为发酵培养的藻种；所述三级种子液在所述发酵罐内的初始接种浓度为5-20%，优选为10%（vv）。在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）藻种活化时所用培养基的组成为每升培养液中：葡萄糖20g，KNO32g，KH2PO41.2g；MgSO4·7H2O1.2g；柠檬酸三钠0.2g；CaCl2母液1mL；FeSO4与EDTA母液1mL；微量元素母液1mL；Agar（琼脂）15g；步骤（2）-（4）中，一级种子培养、二级种子培养和三级种子培养所用培养基的组成为每升培养液中：葡萄糖20g，KNO32g，KH2PO41.2g；MgSO4·7H2O1.2g；柠檬酸三钠0.2g；CaCl2母液1mL；FeSO4与EDTA母液1mL；微量元素母液1mL；所述CaCl2母液是在每1L水中溶解1.5g的CaCl2·2H2O配制而成；所述FeSO4与EDTA母液是在每1L水中溶解2.1g的EDTA与16g的FeSO4·7H2O配制而成；所述微量元素母液是在每1L水中溶解2.86g的H3BO3、0.222g的ZnSO4·7H2O、1.81g的MnCl2·4H2O、0.021g的NaMoO4、0.07g的CuSO4·2H2O配制而成。在本发明一个较佳实施例中，所述发酵基础培养基组成为每升培养基中含有：糖5-20g、氯化铵0.25~1.0g；所述补料培养基组成为每升培养基中含有：葡萄糖750g、氯化铵2.71~37.5g。在本发明一个较佳实施例中，当以获得最大细胞干重为目的时，连续两次取样点样品细胞干重不变或者开始下降时，发酵结束。优选地，所述发酵基础培养基组成为每1L培养基中还含有KH2PO40.3~1.2g、MgSO4·7H2O0.3~1.2g、柠檬酸三钠0.05~0.2g、CaCl2母液1mL、FeSO4与EDTA母液1mL、微量元素母液1mL，消泡剂0.08mL；优选地，所述补料培养基组成为每升培养基中还含有：KH2PO430g、MgSO4·7H2O30g、柠檬酸三钠5g、CaCl2母液12.5mL、FeSO4与EDTA母液12.5mL、微量元素母液12.5mL。而其中，CaCl2母液是在每1L水中溶解1.5g的CaCl2·2H2O配制而成；FeSO4与EDTA母液是在每1L水中溶解2.1g的EDTA与16g的FeSO4·7H2O配制而成；微量元素母液是在每1L水中溶解2.86g的H3BO3、0.222g的ZnSO4·7H2O、1.81g的MnCl2·4H2O、0.021g的NaMoO4、0.07g的CuSO4·2H2O配制而成。本发明设计机理如下：本发明方法以藻细胞吸收利用过程能量消耗更低、利用速度更快的铵盐作为基础培养基和补料培养的氮源，但补料培养基中的氮源相对于补料培养基中碳源的量并不是足量供给的，而是使补料培养基的碳氮比为基础培养基中碳氮比的5-20倍；并在培养过程中，实时监控培养体系的pH值，由于藻细胞生长过程中利用了培养基中的铵盐后会导致培养体系的pH下降，而pH下降得越快表示当前的藻细胞对氮源需求量很大，反之则表示当前细胞对氮源的需求量较小，而培养过程中根据实时监控的pH而添加的氨水同时被作为氮源补充给生长中的藻细胞。由此，藻细胞在生长过程中，实时流加补给的料（由补料培养基和氨水两部分组成）中碳氮比并不是恒定的，氮源的供给量实际上（源于氨水和补料培养基）完全是根据微藻自身生长状况所需自适应补给的。因此，本发明的培养模式不会出现固定碳氮比所带来的微藻生长缓慢的问题，也不会因供氮过量或供氮不足而导致微藻不能正常生长的情况发生。在培养过程中，还兼顾使用了流加补料模式，实时监控培养体系葡萄糖浓度的变化，根据葡萄糖浓度的变化适时调整补料速度，将培养体系中的葡萄糖浓度控制在较为稳定的水平（即浮动很小，任2小时内培养体系葡萄糖浓度变化幅度小于20%），避免碳源的严重过量和严重匮乏导致的生长缓慢问题。本发明的创新点如下：本发明首次提供一种通过氮消耗进行自适应补氮的小球藻Chlorellazofingiensis高密度培养方法，培养过程中包含基础氮源铵盐和辅助氮源氨水两种氮源，同时对发酵基础培养基和补料培养基中的碳氮质量比进行了限定，补料液中碳氮比是基础培养基中的碳氮比的5-20倍；在发酵过程中，对葡萄糖浓度变化幅度进行了限制。本发明的技术效果如下：1、本发明使用吸收利用过程能耗较低的铵盐和氨水作为氮源，使得藻细胞对氮素营养的吸收利用更快、细胞增长速度更快。2、考虑到细胞在不同生长时期对氮的需求差异，本发明培养过程采用基础氮源铵盐和辅助氮源氨水结合的方式，在补料培养基中添加远低于常规氮碳比的铵盐（使铵盐不足），并根据细胞在利用铵盐过程中造成pH下降的特性，本发明通过氨水调控pH并同时作为氮源的提供。本发明可以有效避免现有固定碳氮比流加培养下氮源过量或匮乏对细胞生长的抑制作用，保证细胞浓度的持续增长。3、本发明和已报道的以硝酸盐及尿素等作为氮源培养时使用酸调控pH异养培养过程相比，能够在不影响细胞生长速度和生产率的同时，避免酸对发酵设备的腐蚀作用，提高设备的使用寿命。4、相比于现有固定碳氮比流加培养方式而言，本发明培养方法下氮的供应处于自适应动态变化，微藻根据培养过程中自身生长代谢速度调整氮的供应量，增殖速度快、细胞浓度高，可实现微藻细胞浓度的持续增长。培养230h后，最高细胞干重可达到160gL。附图说明图1为本发明实验组和对照组生物量浓度随时间变化比较。具体实施方式为了进一步理解本发明，以下结合实例对本发明进行描述，但实例仅为对本发明的特点和优点做进一步阐述，而不是对本发明权利要求的限制。以下为本发明的基本实验材料和实验过程：实验材料的准备藻株：小球藻Chlorellazofingiensis小球藻Chlorellazofingiensis培养过程中所用的各培养基组成和用量见附表1-3。小球藻Chlorellazofingiensis整个异养培养过程包括如下5个步骤：1）藻种活化在无菌环境下，用接种环从已培养好（将小球藻Chlorellazofingiensis的藻种涂抹在平板上至长成了菌落）的平板上挑取小球藻Chlorellazofingiensis单菌落，于灭菌平板上（培养基组成见附表1）进行划线，将划线后的平板置于暗环境下进行培养，培养温度25℃，培养15-20天（形成明显的小球藻Chlorellazofingiensis藻单菌落）。2）一级种子培养从活化好的新鲜平板上，挑取一环小球藻Chlorellazofingiensis（Φ2~3mm）于50mL三角瓶中（装液量为15mL）进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpm，培养120-144h（OD750=8）。3）二级种子培养将培养好的一级种子液以10%（vv）接种量接种于250mL二级摇瓶（装液量100mL）中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpm，培养72~84h（OD750=16-20）。4）三级种子培养将培养好的二级种子液以10%（vv）接种量接种于1000mL三级摇瓶（装液量300mL）中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpm，培养72-84h（OD750=20-22）。一级种子培养，二级种子培养、三级种子培养的培养液组分参见表15）发酵罐培养将培养好的三级摇瓶种子液以10%（vv）接种量接种于7.5L发酵罐中，培养温度27℃，通风比为1：1（vvm），搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为20%，培养过程中用氨水控制pH于6.5±0.2。发酵基础培养基采用氯化铵作为氮源，基础培养基中碳氮质量比为5:1-80:1，初始葡萄糖浓度为20gL，当葡萄糖浓度降至3-4gL时，开始使用速度可调的蠕动泵流加补料培养基，补料培养基的氮碳质量比为基础培养基氮碳质量比的120-15补料培养基的碳氮质量比为基础培养基碳氮质量比的5-20，适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个培养过程中的葡萄糖浓度在5gL±40%以内。当以获得最大细胞干重为目的时，连续两次取样点的细胞样品干重不变或者开始下降时，发酵结束。以上，藻种活化和三级种子培养所用的培养液参见表1；发酵罐内异养培养所用的基础培养液和补料培养的组分参见表2所示；各培养基液中所用的母液参见表3。表1为藻种制备培养基（一二三级培养液为每L中所含营养组分）表2发酵罐基础和补料培养基组成表3各培养基液中的母液组成实施例和对照例按照前述小球藻Chlorellazofingiensis整个异养培养过程进行培养，步骤1）-4）完全相同，仅针对步骤5）设置2个实验组和2个对照组。两个对照实验组均参照文献已报道的培养方式，其中：对照1（Control-1）基础培养基和补料培养基均以尿素作为氮源，基础培养基和补料培养基中碳氮质量比保持在34:1不变，培养过程中用3MH3PO4调控pH恒定在6.5±0.2。补料培养基流加速度以糖流加速度计，见表4右栏。对照2（Control-2）基础培养基和补料培养基均以硝酸钠作为氮源，基础培养基和补料培养基中碳氮质量比保持在34:1不变，培养过程中用3MNaOH调控pH恒定在6.5±0.2。补料培养基流加速度以糖流加速度计，见表4右栏。实验组1（Experiment-1）基础培养基和补料培养基以氯化铵作为氮源，基础培养基和补料培养基中碳氮质量比保持在34:1不变，培养过程中用3MNaOH调控pH恒定=6.5±0.2。实验组2（Experiment-2）基础培养基和补料培养基以氯化铵作为氮源，补料培养基中氮碳质量比为基础培养基氮碳质量比的112（补料培养基中碳氮比为基础培养基碳氮比的12倍），培养过程中采用氨水调控pH=6.5±0.2并补充氮源。两个实验组中，葡萄糖浓度控制在相同的水平，即3-6gL。参见图1和表4，比较了以上四种不同实验条件下小球藻Chlorellazofingiensis细胞生物量浓度随时间的变化情况。表4：实验组和对照组的发酵指标比较由图1和表4的结果可知，本发明的方法确实可实现小球藻Chlorellazofingiensis高密度异养培养。实验组1的细胞干重增长速度优于对照组1-2，而实验组2的细胞干重增长速度优于实验组1。相比于现有固定碳氮比流加培养方式而言，本发明培养方法下氮的供应处于自适应动态变化，微藻根据培养过程中自身生长代谢速度调整氮的供应量，增殖速度快、细胞浓度高，可实现微藻细胞浓度的持续增长。培养230h后，最高细胞干重接近160gL，细胞干重增长速度是对照组的2-4倍。

权利要求：1.一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：所述培养方法是将小球藻Chlorellazofingiensis接种到发酵罐中培养，培养过程中使用的基础培养基和补料培养基均以铵盐为氮源，以葡萄糖为碳源；其中，基础培养基中碳氮质量比为5:1-80:1，而补料培养基中碳氮比为基础培养基中碳氮比的5-20倍；在培养过程中，实时监测培养体系的pH值，根据pH值的监测结果，用补加氨水的方式调节培养体系的pH值在6.5±0.2并同时作为氮源补充；在培养过程中，实时监测培养体系的葡萄糖浓度，当基础培养基中的葡萄糖浓度将至3-4gL时开始流加补料培养基，且流加补料培养基的速度满足使每两小时内培养体系中葡萄糖的浓度变化幅度小于20%的要求。2.根据权利要求1所述的一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：所述流加补料培养基的速度满足使培养体系中葡萄糖的浓度保持在5gL±40%。3.根据权利要求1所述的一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：所述基础培养基中葡萄糖的初始浓度为20gL。4.根据权利要求1-3任一项所述的一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：所述异养培养的温度为27-29℃，通风比为1:1-1:0.5，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为20%，且培养过程中用添加氨水的方式调节pH为6.5±0.2。5.根据权利要求1-3任一项所述的一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：所述铵盐为氯化铵。6.根据权利要求1-3任一项所述的一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：在培养过程中，由计算机根据培养体系的实时监测结果，控制速度可调的蠕动泵流加补料培养基和氨水，以控制培养体系的pH和葡萄糖浓度。7.根据权利要求1所述的一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：在接种到发酵罐之前，还包括藻种活化和三级种子扩培得到种子液的过程，即：（1）藻种活化：将藻种接种在平板上培养至形成菌落，在无菌环境下，用接种环从已培养好的平板上挑取小球藻Chlorellazofingiensis单菌落，于灭菌平板上进行划线，将划线后的平板置于无光照环境下进行培养，培养温度25℃，培养时间15-20天，形成明显的小球藻Chlorellazofingiensis藻单菌落；（2）一级种子培养：从步骤（1）活化处理后的平板上，挑取一环小球藻Chlorellazofingiensis（Φ2~3mm）于15~30mL培养基中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpmmin，培养120-144h，使OD750=8，得到一级种子液；（3）二级种子培养：将培养好的一级种子液以10%（vv）接种量接种于100~200mL培养基中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpmmin，培养72~84h，使OD750=16-20，得到二级种子液；（4）三级种子培养：将培养好的二级种子液以10%（vv）接种量接种于300~600mL培养基中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpmmin，培养72-84h，使OD750=20-22，得到三级种子液，所述三级种子液作为发酵培养的藻种；所述三级种子液在所述发酵罐内的初始接种浓度为体积百分数5%~20%。8.根据权利要求7所述的一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：步骤（1）藻种活化时所用培养基的组成为每升培养液中：葡萄糖20g，KNO32g，KH2PO41.2g；MgSO4·7H2O1.2g；柠檬酸三钠0.2g；CaCl2母液1mL；FeSO4与EDTA母液1mL；微量元素母液1mL；Agar琼脂15g；步骤（2）-（4）中，一级种子培养、二级种子培养和三级种子培养所用培养基的组成为每升培养液中：葡萄糖20g，KNO32g，KH2PO41.2g；MgSO4·7H2O1.2g；柠檬酸三钠0.2g；CaCl2母液1mL；FeSO4与EDTA母液1mL；微量元素母液1mL；所述CaCl2母液是在每1L水中溶解1.5g的CaCl2·2H2O配制而成；所述FeSO4与EDTA母液是在每1L水中溶解2.1g的EDTA与16g的FeSO4·7H2O配制而成；所述微量元素母液是在每1L水中溶解2.86g的H3BO3、0.222g的ZnSO4·7H2O、1.81g的MnCl2·4H2O、0.021g的NaMoO4、0.07g的CuSO4·2H2O配制而成。9.根据权利要求1所述的一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：所述发酵基础培养基组成为每升培养基中含有：葡萄糖5-20g、氯化铵0.25~1.0g；所述补料培养基组成为每升培养基中含有：葡萄糖750g、氯化铵2.71~37.5g。10.根据权利要求1所述的一种小球藻Chlorellazofingiensis异养高密度培养方法，其特征在于：当以获得最大细胞干重为目的时，连续两次取样点样品细胞干重不变或者开始下降时，发酵结束。

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