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申请/专利权人：复旦大学附属肿瘤医院

摘要：本发明属生物医学的临床检测技术领域，具体涉及MFAP5在制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群标志物的制剂中的用途。本发明采用RNA‑seq高通量表达谱测序的方法对α干扰素干预与未干预的肝癌患者组织样本进行检测分析，筛选出有表达差异的分泌蛋白MFAP5，用免疫组化、Western blot和ELISA三种方法进行鉴定，证明该MFAP5分泌蛋白在α干扰素干预与未干预的人肝癌组织中具有显著表达差异，同时在人外周静脉血中存在明显表达差异，该MFAP5是α干扰素干预肝癌过程中的关键分子，可作为筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的标志物，进一步用于筛选α干扰素干预疗肝癌敏感人群，且准确度高。

主权项：1.MFAP5在制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群标志物的制剂中的用途。

全文数据：MFAP5在制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群标志物的制剂中的用途技术领域本发明属生物医学的临床检测技术领域，涉及MFAP5蛋白的新的医用用途，具体涉及MFAP5蛋白作为检测标志物在用于制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的制剂中的用途。背景技术资料公开了原发性肝癌Hepatocellularcarcinoma，HCC居全球恶性肿瘤发病率第六位，死亡率第二位，是我国第二大肿瘤致死原因。经过几十年的努力，我国肝癌研究已经取得显著进展，但其根治性切除术后5年转移复发率仍然大于60％。术后复发转移仍是进一步改善肝癌患者预后的主要障碍。迄今为止临床可用的能有效抑制肝癌术后转移复发的药物仍为鲜见。现有技术公开了α干扰素作为一个多用途的细胞因子，一直被列为慢性乙型肝炎的一线用药。近些年的研究逐渐发现其在实体肿瘤中具有抑制肿瘤生长及转移复发的作用。在众多抗癌药物中，α干扰素是少数对肝癌有效的药物之一，具有巨大的临床应用价值；有研究显示，不同荷瘤个体对药物敏感性存在差异，导致α干扰素对肝癌患者的总体疗效目前还不能完全满足临床要求，业内认为其疗效能否进一步提高主要依赖于寻找有效的识别敏感人群的分子标志。现有技术公开了MFAP5是一种多功能蛋白，在弹性微纤维组装和调节内皮细胞行为中起重要作用，被认为是细胞存活的新型调节剂，然而MFAP5在癌症中的作用仍有待阐明。α干扰素目前已广泛用于临床抗肝癌转移复发治疗，但是，迄今为止，尚未见关于MFAP5作为筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的标志物的报道。基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供MFAP5蛋白的新的医用用途，具体涉及MFAP5蛋白作为检测标志物在用于制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的制剂中的用途。发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供MFAP5蛋白的新的医用用途，具体涉及MFAP5蛋白作为检测标志物在用于制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的制剂中的用途。本发明提供了MFAP5蛋白或其特异性抗体作为检测标志物在用于制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的制剂中的用途。本发明采用RNA-seq高通量表达谱测序的方法对α干扰素干预与未干预的人肝癌组织进行检测分析，筛选出有表达差异的分泌蛋白MFAP5，用免疫组化、westernblot和ELISA三种方法进行鉴定，证明该蛋白在α干扰素干预与未干预的人肝癌组织中具有显著表达差异，MFAP5的mRNA和蛋白水平在预后不良的患者中显着升高，同时在人外周静脉血中存在明显差异，所述的MFAP5蛋白或其特异性抗体可作为α干扰素干预肝癌过程中的关键分子以及作为诊断α干扰素治疗肝癌敏感人群的标志物，进一步用于制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的制剂，且诊断的准确度高。本发明的进一步目的是，提供一种用于检测筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的试剂盒。为实现上述进一步目的，本发明采取的技术方案是：一种用于检测筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的试剂盒，所述的试剂盒包含检测MFAP5蛋白含量的试剂。本发明的实施例中，所述的用于检测筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的试剂盒10人份有下述组分制成：2.5ugml人源性可溶性MFAP5抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG，DAB显色液武汉博士德公司，苏木素复染液，和3％H2O2。本发明的实施例中，采用制得的试剂盒对肝癌组织和癌旁组织进行实验检测结果显示，按照染色程度+＜20％、++20-50％、+++51-75％、++++76-100％4级进行评分，分析结果显示，肝癌中MFAP5阳性率达到41.81％，具有显著性差异如图1所示；本发明的实施例中采用Westernblot进行肝癌临床样本的检测，结果显示，鉴定的MFAP5阳性标本符合Westernblot检测结果如图2所示；本发明的实施例中，采用ELISA进行肝癌临床样本的检测，结果显示鉴定的MFAP5阳性标本符合Westernblot检测结果如图3所示；本发明的实施例中，将收集的肝癌患者及正常病人血液标本，利用ELISA试验，结果显示，MFAP5的mRNA和蛋白水平在肝癌患者及正常病人外周静脉血中存在明显差异；本发明的实施例中，将所获得的数据与医院提供的预后、复发率数据比对后显示，MFAP5阳性患者显现出治疗预后差，复发率高的结果，因此，所述的MFAP5可作为肝癌预后复发的评判标准，具有显著性差异如图4所示。本发明进一步制备了一种能检测筛选α干扰素干预肝癌敏感人群的标志物的试剂盒，为MFAP5用于肝癌α干扰素干预肝癌敏感人群的筛选提供临床参考依据。与现有技术相比，本发明所述的MFAP5试剂盒具有如下优点和显著性进步：1、敏感性：本发明的试剂盒敏感性极高，该MFAP5抗体与现有技术其它的肝癌标志物相比，阳性强度可以达到++++，符合临床监测标准。2、准确性：本发明的试剂盒准确性极高，MFAP5抗体与现有技术其它的肝癌标志物相比，准确率较高，符合临床监测标准。附图说明图1.本发明用于肝癌患者免疫组化实验的图片20X：图示结果显示MFAP5在α干扰素干预肝癌患者中表达呈阳性；在α干扰素治疗肝癌患者癌旁中表达呈阴性。图2.Westernblot验证MFAP5在所述肝癌患者癌组织及癌旁组织中的表达，结果显示与图1的结果相符合。图3.ELISA验证MFAP5在肝癌患者血清的中的表达统计图，结果显示在肝癌患者血清中MFAP5的表达与健康人比较有明显的差异，P＜0.001；结果显示与图1和图2的结果相符合。图4.肝癌患者MFAP5阳性与预后，复发的关系：根据实施例1和2筛选出的肝癌患者MFAP5阳性患者，通过与治疗预后数据比对后发现，MFAP5阳性患者经干扰素治疗后预后佳，复发率低，具有显著性差异，表明MFAP5可以作为α干扰素治疗肝癌患者敏感人群筛选的标志物。下面结合实施例和附图对本发明作详细说明，但本发明的实施并不仅限于此。具体实施方式本发明使用的能够检测人外周静脉血MFAP5表达量的试剂盒，由人源性MFAP5抗原的抗体，HRP辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，DAB显色液和苏木素复染液组成。实施例1试剂盒组成：肝癌α干扰素治疗敏感人群筛选诊断试剂盒10人份[12.5ugml人源性可溶性MFAP5抗体0.5ml2HRP标记的羊抗鼠IgG0.5ml3DAB显色液武汉博士德公司0.5ml4苏木素复染液0.5ml53％H2O20.5ml试剂盒的使用方法：1烤片：91.7℃，30min；取出后置入二甲苯I中；2脱蜡：先后置入二甲苯I和II各10min；3酒精水化：依次置入不同浓度的酒精100％、95％、80％、75％各5min；4用PBS洗片，5min，3次。灭活内源性过氧化物酶：每片予以200ulH2O26％，置于湿盒15min。用PBS洗片，5min，3次；5热修复：在1×EDTA修复液中置入切片。煮沸，微波炉低火10min，冷却3min后，再低火7min。切片抗原予以5％BSA封闭，放入湿盒20min，弃除BSA，按抗体说明书指示加入一抗。4℃，放入湿盒孵育18hrs，用PBS洗片，5min，3次；6常温下，加入A液湿盒中孵育30min，再次用PBS洗片，5min，3次，置入DAB工作液后，即刻在显微镜下观察，适时加入PBS中终止反应，苏木精复染后，摇匀，PBS冲洗。加HCl脱色；76.1脱水：各级酒精，浓度由低至高75％、80％、％％、100％各5min；二甲苯各5min。86.1封片：二甲苯中拿出切片，风干，加少许中性树胶，予洁净盖玻片封片。实施例2试剂盒进行肝癌临床样本的检测收集了肝癌临床标本170例，包括肝癌组织和癌旁组织如图1所示，根据试剂盒使用说明方案进行实验，结果显示，按照染色程度+＜20％、++20-50％、+++51-75％、++++76-100％4级进行评分，最后用统计软件进行分析，肝癌中MFAP5阳性率达到41.81％，具有显著性差异。实施例3Westernblot进行肝癌临床样本的检测将收集的10对肝癌手术样本，Westernblot进行试验，结果显示实施例2中鉴定的MFAP5阳性标本符合Westernblot检测结果如图2所示。实施例4ELISA进行肝癌临床样本的检测将收集的10例肝癌患者及正常病人血液标本各5例，利用ELISA试验，结果显示，实施例2中鉴定的MFAP5阳性标本符合Westernblot检测结果如图3所示。实施例5根据实施例2和实施例3所得数据与医院提供的预后，复发率数据比对后发现，MFAP5阳性患者出现治疗预后差，复发率高，具有显著性差异如图4所示，因此MFAP5可以作为肝癌预后复发的评判标准参考标志。本发明经实验研究，制备了一种能够检测筛选α干扰素治疗肝癌敏感人群的标志物的试剂盒，为MFAP5在肝癌α干扰素治疗肝癌敏感人群的筛选提供临床参考依据，与现有技术相比，本发明涉及的MFAP5试剂盒具有如下优点和显著性进步：1、敏感性：本发明的试剂盒敏感性极高，该MFAP5抗体与市面上其它的肝癌标志物相比，阳性强度可以达到++++，符合临床监测标准；2、准确性：本发明的试剂盒准确性极高，MFAP5抗体与市面上其它的肝癌标志物相比，准确率较高，符合临床监测标准。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.MFAP5在制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群标志物的制剂中的用途。2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的MFAP5在α干扰素干预与未干预的人肝癌组织中具有显著表达差异。3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的MFAP5阳性肝癌患者预后明显差于PAPSS1阴性患者；MFAP5阴性肝癌患者经α干扰素干预后能明显改善患者预后，具有显著性差异。4.一种用于检测鉴定α干扰素干预肝癌敏感人群的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测MFAP5蛋白含量的试剂。5.按权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由2.5ugml人源性可溶性PAPSS1抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG，DAB显色液、苏木素复染液、3％H2O2组成。

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