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申请/专利权人：彝良县天麻产业开发中心

摘要：本发明涉及乌天麻栽培技术领域，具体涉及法国蜜环菌小草坝1号及其在乌天麻栽培中的应用。法国蜜环菌小草坝1号保藏编号为：CGMCCNo.16781。实验证明，采用法国蜜环菌Armillariagallica新菌株小草坝1号栽培乌天麻，既可以提高乌天麻产量还可以提高品质。法国蜜环菌Armillariagallica新菌株小草坝1号的胞外漆酶活力、胞外纤维素酶活力、胞外木聚糖活力、胞外果胶酶活力、胞外淀粉酶活力显著高于其它菌株，生长速度较快，在用于菌种制作时缩短生产周期。另外该菌多糖含量较高，显示出较高的药用价值。

主权项：1.法国蜜环菌（Armillariagallica）小草坝1号，其保藏编号为：CGMCCNo.16781。

全文数据：法国蜜环菌小草坝1号及其在乌天麻栽培中的应用技术领域本发明涉及乌天麻栽培技术领域，具体涉及法国蜜环菌新菌株及其应用。背景技术天麻GastrodiaelataBlume为兰科多年生共生草本植物，是传统的名贵中药。天麻具有镇静、镇痛、抗惊厥、抗衰老、有助于记忆力、改善循环及免疫功能等药理作用。天麻的营养方式为异养型，早在1911年就发现天麻的营养来源是消化侵染的蜜环菌。根据花的颜色、花茎的颜色、块茎的形状、块茎的含水量等不同，天麻划分为4个类型，即原变型-红天麻G.elataBl.f.elata、绿天麻G.elataBl.f.viridisMakino、乌天麻G.elataBl.f.glaucaS.Chow、黄天麻G.elataBl.f.flavidaS.Chow。在生产中栽培最多的主要是红天麻和乌天麻。蜜环菌属Armillaria隶属于膨瑚菌科Physalacriaceae，是一个世界性分布的属，全球报道约有50余种，该属真菌既是重要的林木病原菌，也是重要的食用菌，其中一部分还是名贵中药天麻的共生菌。云南省昭通市是我国公认的天麻地道药材产地，主要位于五莲峰山脉和乌蒙山脉的交汇地带，这一带由于受特殊的“昆明准静止峰”气候类型影响，创造了最适宜天麻生长的环境。昭通市彝良县小草坝镇被誉为世界天麻的原产地，所产的乌天麻是云南天麻的代表，更是昭通天麻的代表。不同种类的蜜环菌自然分布在不同的地理区域，而且并非同一个地域范围的蜜环菌种类都与天麻具有良好共生关系。蜜环菌不同菌株对天麻产量和质量会产生不同的影响，表现出显著性差异。目前天麻栽培生产中，蜜环菌菌种生产比较混乱，随意分离蜜环菌菌种，不经试验直接投入生产，导致烂麻、天麻产量和品质下降的事件屡屡发生。因此挑选合适的蜜环菌用于天麻栽培生产和产业发展具有重要意义。发明内容本发明筛选得到一株法国蜜环菌新菌株，适用于乌天麻优质高产栽培，可以提高乌天麻产量和品质。本发明提供的法国蜜环菌Armillariagallica新菌株小草坝1号，已于2018年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCCNo.16781。本发明提供的法国蜜环菌Armillariagallica新菌株小草坝1号CGMCCNo.16781是从云南省彝良县小草坝镇野生天麻分离获得的。该菌株的形态特征如下：菌丝体特征：菌丝乳白色，在黑暗处有萤光。菌丝容易在培养基内形成菌索，幼龄菌索未端呈棕红色，壮龄菌索表面光滑粗壮并呈暗红色，老龄菌索表面呈黑褐色。子实体特征：菌盖锥形、凸形或平顶。菌盖棕黄色到棕色，中心颜色较深。菌盖表面覆盖有细纤毛，直立或倾斜向上。初期子实体菌盖下表面有一层絮状组织，从菌盖边缘伸展到菌柄上。菌褶最初为白色，逐渐变为奶油色或浅橙色，并覆盖锈色的斑点。菌褶联生或稍沿菌柄向下延伸。菌柄长4-10厘米。菌环以上，菌柄为浅橙色到棕色；菌环以下，菌柄呈白色或浅粉红色；基部为灰棕色。孢子印呈白色。孢子椭球形。菌盖角质层由不规则交织的菌丝组成，向上突出形成鳞状物。菌丝中存在锁状联合。生物学特性：营养成分来源，小草坝1号可用改良PDA培养基马铃薯200g，麦麸50g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，盐酸噻胺0.1g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，pH自然保存，适宜在4℃冰箱低温冷藏保存，每3个月转接1次。小草坝1号的菌种扩繁生产：母种生产适宜用改良PDA培养基培养；原种和栽培种生产适宜用以小树枝、水为主料，玉米粉为辅料组成的培养基。培养及栽培条件：菌索生长温度9℃～38℃，最适20℃～23℃。本发明还提供上述法国蜜环菌Armillariagallica新菌株小草坝1号CGMCCNo.16781在乌天麻栽培中的应用。可采用本领域常规方法栽培乌天麻。实验证明，采用法国蜜环菌Armillariagallica新菌株小草坝1号CGMCCNo.16781栽培乌天麻，既可以提高乌天麻产量还可以提高品质。具体地，本发明还提供一种乌天麻的栽培方法，其采用树棒、乌天麻种栽“三下窝”方式、仿野生栽培；天麻栽培穴长×宽×深为70cm×40cm×25cm；每穴摆放直径5～12cm、长度30cm的树棒5根，上述法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号CGMCCNo.16781菌种1瓶净重约680g，乌天麻种栽200g。其中，所述树棒可为本领域常规选择；可采用本领域常规方法制备所述法国蜜环菌菌种。本发明还提供采用法国蜜环菌Armillariagallica新菌株小草坝1号CGMCCNo.16781栽培所得的乌天麻。本发明还提供乌天麻生药材，是采用上述法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号CGMCCNo.16781栽培所得的乌天麻加工而得。可采用本领域常规方法例如药典方法进行加工。具体例如将乌天麻采挖后，洗净，蒸透，敞开低温干燥。本发明还提供上述法国蜜环菌Armillariagallica新菌株小草坝1号CGMCCNo.16781在制备食品、保健食品或药物上的应用。采用法国蜜环菌Armillariagallica新菌株小草坝1号CGMCCNo.16781进行培养，实验证明该菌的胞外漆酶活力、胞外纤维素酶活力、胞外木聚糖活力、胞外果胶酶活力、胞外淀粉酶活力显著高于其它菌株，生长速度较快，在用于菌种制作时缩短生产周期。另外该菌多糖含量较高，显示出较高的药用价值。附图说明图1为实施例1四株蜜环菌的系统发育N-J树。图2、图3、图4分别为实施例2乌天麻栽培试验天麻产量、天麻有效成含量、天麻的天麻素和对羟基苯甲醇UPLC图。图5、图6、图7、图8、图9、图10分别为实施例3中AM1、AM2不同时期胞外漆酶活力、胞外纤维素酶活力、胞外木聚糖活力、胞外果胶酶活力、胞外淀粉酶活力、多糖含量变化情况图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。实施例1菌株的获得、菌种鉴定1.1菌株分离从云南省彝良县小草坝镇野生天麻带菌索的天麻块茎分离获得两株蜜环菌，编号为AM1、AM4。具体分离方法如下：利用清水洗净天麻上的泥土，自来水流淌15分钟后无菌水冲洗3次，用0.1％升汞溶液浸泡1-2分钟，无菌水冲洗2-3次，去掉残留消毒液，然后用无菌刀切取所需要的部分组织置于无菌培养皿中，用无菌滤纸吸取表面水分，置于添加有氯霉素的PDA培养基的培养皿上，在25℃恒温条件下培养5天开始长出新菌索。上述菌株AM1、AM4的形态特征如下：菌丝体特征：菌丝乳白色，在黑暗处有萤光。幼龄菌丝未端呈棕红色，壮龄菌丝表面光滑粗壮并呈暗红色，老龄菌丝表面呈黑褐色。子实体特征：菌盖锥形、凸形或平顶。菌盖棕黄色到棕色，中心颜色较深。菌盖表面覆盖有细纤毛，直立或倾斜向上。初期子实体菌盖下表面有一层絮状组织，从菌盖边缘伸展到菌柄上。菌褶最初为白色，逐渐变为奶油色或浅橙色，并覆盖锈色的斑点。菌褶联生或稍沿菌柄向下延伸。菌柄长4-10厘米。菌环以上，菌柄为浅橙色到棕色；菌环以下，菌柄呈白色或浅粉红色；基部为灰棕色。孢子印呈白色。孢子椭球形。菌盖角质层由不规则交织的菌丝组成，向上突出形成鳞状物。菌丝中存在锁状联合。生物学特性：营养成分来源，可用改良PDA培养基马铃薯200g，麦麸33g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，盐酸噻胺0.1g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，pH自然保存，适宜在4℃冰箱低温冷藏保存，每3个月转接1次。菌种扩繁生产：母种生产适宜用改良PDA培养基培养；原种和栽培种生产适宜用以小树枝、水为主料，玉米粉为辅料组成的培养基。1.2菌种鉴定另取两株生产上用于天麻栽培的蜜环菌菌株Armillariaspp.A9和京234，均来源于中国医学科学院药用植物研究所，编号为AM2即A9，AM3即京234。蜜环菌A9和京234为目前栽培天麻用的主流栽培品种。将以上AM1、AM2、AM3、AM4四株蜜环菌菌株，分别接种于改良的PDA培养基中，25℃培养。将培养好的蜜环菌从培养基中剥离，放入研钵中，加入适量石英砂和液氮充分研磨，基因组DNA提取方法按照“植物基因组DNA提取试剂盒”的说明书步骤操作。扩增序列为rDNA-ITSSEQIDNO:1、β-tubulinSEQIDNO:2和tef1-αSEQIDNO:3，采用引物见表1。PCR反应体系25μL：反应引物10μM1μL，DNA模板1μL，2×TaqPCRMix12.5μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应条件：预变性94℃，3min；循环条件：变性：94℃，30s；退火：rDNA-ITS和tef1-α为55℃，30s，β-tubulin为53℃，40s；72℃延伸：rDNA-ITS为120s，β-tubulin为90s，tef1-α为30s，以上循环30次；延伸72℃5min。其中tef1-α序列采用两步PCR反应扩增，第一步反应使用引物EF526F、EF1567R，第一步的PCR产物作为第二步反应的模板。第二步反应使用引物EF595F、EF1160R，进行扩增。表1引物序列及名称PCR产物取5μL经1％琼脂糖凝胶电泳检测，将条带明亮且唯一的PCR产物进行双向测序。其余产物则切下目的基因片段，使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收，使用零背景pTOPO-TA克隆试剂盒及大肠杆菌DH5α感受态细胞对回收的DNA片段进行克隆。将37℃过夜培养的菌落挑出，在无菌环境下，转入液体LB培养基中3mL，并加入3μL氨苄50mg·mL-1，37℃180rpm恒温培养箱恒温培养4h以上，变浑浊的菌液进行双向测序。菌液测序采用通用引物M13F5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′、M13R5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′。使用Excel2016和SPSS19.0对数据进行处理和分析，GraphPad7.0进行绘图，DNAMAN对基因的同源性分析，MEGA7.0画出系统发育N-J树。结果见图1所有蜜环菌菌株序列为rDNA-ITS、β-tubulin和tef1-α的合并序列。分别将菌株AM1、AM2、AM3、AM4的rDNA-ITS、β-tubulin和tef1-α三个基因片段合并在一起后使用DNAMAN分析其同源性和遗传距离表2发现，AM1与AM3的同源性达到了99.2％，遗传距离较近为0.005；AM2与AM1和AM3分别为98.9％和98.7％，遗传距离稍远；AM4菌株与三者同源性仅约为75％，与AM1距离为0.246，M2AM2为0.242，AM3为0.251，遗传距离较远。表2四株不同蜜环菌菌株的相似性和遗传距离表注：表2的上半部分为遗传距离，下半部分为相似性，**为分隔线将测得的序列片段在NCBI上比对AM1、AM2和AM3聚在了一支，支持率为99％。HKAS85563、HKAS85572、HKAS85567、HKAS86560、HKAS86559和HKAS86564为法国蜜环菌，AM1与其聚在了同一支上，支持率高达99％。即分子鉴定结果表明菌株AM1为法国蜜环菌。将以上菌株AM1命名为法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号，并于2018年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCCNo.16781。实施例2乌天麻栽培试验本实施例检验法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号CGMCCNo.16781用于天麻伴栽对产量、质量的影响。为简便描述，仍将该菌株编号为AM1。以实施例1中记载的蜜环菌AM2、AM3、AM4为对照，将以上四个菌株进行天麻伴栽实验。乌天麻种栽来源：彝良县小草坝当地产的乌天麻一代种栽；栽培地点：小草坝天麻示范园，海拔2010m，104°12′2″E、27°45′21″N。采用“三下窝”的栽培方式，即采用树棒、不同蜜环菌菌株生产种、乌天麻种栽三者同时放置栽培穴的方法，于2017年3月20日进行栽培；天麻栽培穴长×宽×深60cm×45cm×20cm，每穴摆放直径5～15cm、长度25cm的树棒5根，栽培一层，蜜环菌菌种1瓶，乌天麻种栽200g。仿野生栽培，2017年11月20号对天麻进行采收。天麻产量结果见图2，天麻有效成含量见图3，天麻的天麻素和对羟基苯甲醇UPLC见图4。图3中，A：天麻素含量；B：对羟基苯甲醇含量；C：天麻素和对羟基苯甲醇总含量；D：多糖含量；**表示各组分相比存在P彝良县天麻产业开发中心法国蜜环菌小草坝1号及其在乌天麻栽培中的应用13SIPOSequenceListing1.01832DNA人工序列ArtificialSequence1ggaaggatcattattgaaacttgaatcgtagcatcgagaactgttgctgacctgttaaag60ggtatgtgcacgttcgacgtgttgcgttctattcatccacctgtgcacctttgtagactt120gattaactttcgctttcgagcggttagaagggttgctttcgagctccctttgtctatcaa180gtctatgtctatataatctcttgtatgtctagaatgtcttgtttatgggatgcaagtcct240ttaaatcttatacaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgca300gcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgc360accttgcgccctttggtattccgaagggcatgcctgtttgagtgtcattaaattctcaac420ctccccttctttcattaggagtgcggcggattggatatgggggtttgctggtttctaacg480agatcagctcctctgaaatgcattagcagaaaccgtttgactttggctgctaggctgtga540taatatctacgccttgtagttgggtcggaatacgagtcatacagtggtaactaatcaggc600tttcgggtctggcttagaatcggtttggaaggtgcttaacggctccttctgctttctccc660tttgcggagatacttgtccaattctaagagaggagttgcttagcgcgggcttagctttcc720ttgatatttccctttgactttgtagaaggattcagcttctaaccgtccattgacttggac780aatttattgactatttgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttag8322877DNA人工序列ArtificialSequence2ataacaagtgtgcattttatgcgtttttgtaccaactcgcactataggccaagtcaatga60aaactcgccctacagccaccaaaattgttgcaaaccgatcttgaccaatggtttacttag120caaacctttcgtttcagaaccagttgccgttcaaattttgaacgtagccctcgaaagcta180agcaaacggttgaaacggctaaaaaggtaaccgtagcttaacttacttagcttctaaggc240cttttcaatcatggcaaccttagggcaggccctcaggctcactaacgatccagaaaatca300gtcgtcgactcgccctttcaaggatcttggctataccatatacgggatatcggccataag360gtcgatatcaagtacaaggtaaagaccgttccaagtcagcgcacggttagagcttgctaa420ctaagtgccttataagccttcaaggctcataataactcgtgattcaaaagagaaaggtaa480caaaacactaaggcgttgttgttagcctaccctttcgaatctaagtaacatgctgtcgcg540agtgcacaaaggatactatcccggccctcaaggtctcagcatgtaaaaagaaaagagaaa600gtccaacaaagttgaacaaatctttagaacaagggcttaacctcagtggatcgtagcaac660aaggctactctaccacttacagtaccccgttcccattcaagtcgtctgcaaaggattcac720cgccgcccatattatgattacaattcgtagacaagtcgcccaagcgtttccgcaaagaca780acccagcccaccatatttggttcacgagcaaagctctatttaaacacaagtctaatgtgc840gacaccaacatcatcgtttctagcacggattctgact8773581DNA人工序列ArtificialSequence3cgtgacttcatcaagaacatgatcaccggtacctcccaggctgattgtgccatcctcatc60atcgctggtggaactggtgagttcgaggccggtatctccaaggacggtcagacccgagag120cacgccctccttgccttcaccctcggtgtcaggcagctcattgtcgccgtcaacaagatg180gacaccaccaaggtacgagatctgctgctttgtcttttgtttagccaaatctgactgtta240tctcagtggagcgaggaccggttcaacgaaatcgtcaaggaaacctctaccttcatcaag300aaggtcggctacaaccccaaggccgttgctttcgtccccatctctggatggcacggtgat360aacatgttggaggagtccgccaagtaagtctttacccaactatgatcagtgctgtttctt420aacgttctctgtagcatgccatggtacaagggctggaccaaggagaccaaggccggtgtc480gtcaagggcaagactctcctcgatgccattgacgccattgagccccctgtccgtccctcc540gacaagcctctccgtctccctctccaggacgtctacaagat581419DNA人工序列ArtificialSequence4tccgtaggtgaacctgcgc19520DNA人工序列ArtificialSequence5tcctccgcttattgatatgc20617DNA人工序列ArtificialSequence6ggtgcgggtaactgggc17720DNA人工序列ArtificialSequence7gaggcagccatcatgttctt20820DNA人工序列ArtificialSequence8gtcgtygtyatygghcaygt20923DNA人工序列ArtificialSequence9achgtrccrataccaccratctt231021DNA人工序列ArtificialSequence10cgtgacttcatcaagaacatg211120DNA人工序列ArtificialSequence11ccgatcttgtagacgtcctg201218DNA人工序列ArtificialSequence12tgtaaaacgacggccagt181318DNA人工序列ArtificialSequence13caggaaacagctatgacc18

权利要求：1.法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号，其保藏编号为：CGMCCNo.16781。2.权利要求1所述法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号在乌天麻栽培中的应用。3.乌天麻的栽培方法，其特征在于，采用树棒、乌天麻种栽“三下窝”方式、仿野生栽培；天麻栽培穴长×宽×深为60cm×45cm×20cm；每穴摆放：直径5～15cm、长度25cm的树棒5根，权利要求1所述法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号菌种1瓶，乌天麻种栽200g。4.采用权利要求1所述法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号栽培所得的乌天麻。5.乌天麻生药材，是采用权利要求1所述法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号栽培所得的乌天麻加工而得。6.权利要求1所述法国蜜环菌Armillariagallica小草坝1号在制备食品、保健食品或药物上的应用。

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