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申请/专利权人：云南省林业和草原科学院

摘要：本发明公开一种格力兜兰种子非共生萌发的培养方法，如下步骤：将格力兜兰果荚清洗、消毒灭菌，后在无菌操作台上用无菌剪刀将果荚剪为两段，将种子播散到已灭菌的萌发培养基中，在暗室中25℃暗培养，以出现白色原球茎作为种子萌发的标志。种子产生白色原球茎后，统计格力兜兰种子萌发率。种子萌发形成原球茎后，将其转入光照下继续培养，原球茎全变为绿色后，转接至格力兜兰原球茎转接培养基中继续光照培养。所述的格力兜兰种子萌发培养基以花宝1号为基础培养基，内添加蔗糖和琼脂，并分别添加有活性炭、椰子粉，该格力兜兰种子萌发培养方法及萌发培养基的使用，能促使格力兜兰种子萌发，并提高种子的萌发率，为格力兜兰种子成苗及引种回归奠定基础，有利于格力兜兰保育工作的开展。

主权项：1.一种格力兜兰种子非共生萌发的培养方法，步骤如下：（1）采集成熟但未裂开的格力兜兰果荚，用软毛刷蘸取洗衣粉清洗表面后自来水清洗，在无菌工作台用蒸馏水清洗果荚表面后，用质量浓度为70%-75%的酒精擦拭果荚表面20-30s，再用质量浓度5%-10%的次氯酸钠溶液浸泡消毒15-20min，灭菌蒸馏水冲洗干净，用无菌剪刀将果荚剪成两段，获得格力兜兰种子；其特征在于，还包括如下步骤：（2）用无菌镊子夹着包含格力兜兰种子的果荚，将种子播撒于种子萌发培养基表面，于25℃下暗培养至种子萌发，统计种子萌发率；种子萌发培养基产生白色原球茎后，将其转移至光照下继续培养，光照时间为12hd，待原球茎全变为绿色后，转接至格力兜兰原球茎转接培养基中继续光照培养；所述的种子萌发培养基配方为：1gL的花宝1号、7gL琼脂、20gL蔗糖、0.5gL活性炭粉和10gL椰子粉；所述种子萌发培养基配制：称取1g花宝1号粉末，用1L加热沸腾的蒸馏水溶解，再加入20g蔗糖和7g琼脂作为基础培养基，在基础培养基中同时加入10g椰子粉和0.5g活性炭后，超声溶解1h，使琼脂完全溶解，活性炭均匀分散，将配制的种子萌发培养基分别取20ml倒入50ml三角瓶中分装，共设10个重复，用封口膜将三角瓶瓶口密封；（3）在超净工作台中将原球茎全变绿的种子萌发培养基用无菌小刀切成直径约5mm的圆形琼脂块，用无菌镊子夹着琼脂块转接到格力兜兰原球茎转接培养基中，每个转接培养基均匀的放4-5个琼脂块，转接完成后置于光照下继续光照培养，光照时间为12hd；所述的格力兜兰原球茎转接培养基配方为：1gL花宝1号、7gL琼脂、20gL蔗糖、0.5gL活性炭粉、10gL椰子粉、1.0mgL细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和0.2mgL植物生长素萘乙酸（NAA）。

全文数据：一种格力兜兰种子非共生萌发的培养方法[0001]技术领域：本发明属于植物种子繁殖领域，具体涉及一种格力兜兰种子非共生萌发培养方法。[0002]背景技术：格力兜兰Paphiopedii™grairixianuffi为兜兰属植株，主要分布于云南东南部、老挝及越南北部，为地生或石上附生植物。兜兰属的所有种均为“濒危野生动植物种国际贸易公约”（CITES附录I物种，在《全国极小种群野生植物拯救保护工程规划（2011-2015年》中，包括格力兜兰在内的7种兜兰被列为优先保护对象开展拯救保护工作。格力兜兰活体现存数极少，保育工作开展刻不容缓。[0003]兜兰种子细小如尘，无胚乳，和大多数兰科植物一样，无法提供种子萌发所必需的养分，这是兜兰属植株难以成苗，面临濒危的一个重要原因。目前，兜兰的繁殖主要以种子非共生萌发为主，而种子非共生萌发中萌发培养基对种子的萌发率影响巨大。并且，不同种的兜兰由于种子结构和成熟时间有差异，导致种子萌发的方法不具有广泛适应性。发明内容[0004]本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的不足，提供一种能提尚格力兜兰种子萌发率的培养方法，该方法及采用的培养基能促进格力兜兰种子萌发，并提高种子的萌发率。[0005]本发明通过如下技术方案予以实现：一种格力兜兰种子非共生萌发的培养方法，步骤如下：1采集成熟但未裂开的格力兜兰果荚，用软毛刷蘸取洗衣粉清洗表面后自来水清洗，在无菌工作台用蒸馏水清洗果荚表面后，用质量浓度为70%-75%的酒精擦拭果荚表面20-30s，再用质量浓度5%-10%的次氯酸钠溶液浸泡消毒15-20min，灭菌蒸馏水冲洗干净，用无菌剪刀将果荚剪成两段，获得格力兜兰种子;还包括如下步骤：2用无菌镊子夹着包含格力兜兰种子的果荚，将种子播撒于种子萌发培养基表面，于25°C下暗培养至种子萌发，统计种子萌发率;种子萌发培养基产生白色原球茎后，将其转移至光照下继续培养，光照时间为12hd，待原球茎全变为绿色；所述的种子萌发培养基配方为：1gL的花宝1号、7gL琼脂、20gL蔗糖、0.5gL活性炭粉和10gL椰子粉；3在超净工作台中将原球茎全变绿的种子萌发培养基用无菌小刀切成直径约5mm的圆形琼脂块，用无菌镊子夹着琼脂块转接到格力兜兰原球茎转接培养基中，每个转接培养基均匀的放4-5个琼脂块，转接完成后置于光照下继续光照培养，光照时间为12hd;所述的格力兜兰原球茎转接培养基配方为：1gL花宝1号、7gL琼脂、20gL蔗糖、〇.5gL活性炭粉、10gL椰子粉、1.0mgL细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤6-BA和0.2mgL植物生长素萘乙酸NAA。[0006]步骤（1中所述格力兜兰果荚表面的消毒方法为:先用质量浓度为75%酒精擦拭果荚表面，然后用质量浓度10%次氯酸钠溶液浸泡消毒20min，后用大量灭菌蒸馏水进行清洗。[0007]步骤⑵中所述格力兜兰种子暗培养萌发的时间为54天。[0008]本发明所用的种子萌发培养基以IgL的花宝1号为基础培养基，培养基中加入了7gL琼脂和20gL蔗糖，分别还添加了0.5gL活性炭粉、10gL椰子粉及活性炭和椰子粉的混合物作为格力兜兰种子萌发的培养基。本发明所述的种子萌发培养基在实施案列中均能促使格力兜兰种子萌发。本发明所述的种子萌发培养基中，IgL的花宝，7gL琼脂和20gL蔗糖，同时加入0.5gL活性炭粉和10gL椰子粉实验组3能明显促进格力兜兰种子萌发，使萌发率提尚。[0009]本发明采用成熟未开裂的果荚，一个目的是确保了种子的萌发活力，另一个目的确保种子无污染，能最大限度的促使萌发实验成功。[0010]本发明所述的原球茎转接培养基，内含细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤6-BA和植物生长素萘乙酸NAA，能促进原球茎的生长发育。[0011]该格力兜兰种子萌发培养方法及萌发培养基的使用，能促使格力兜兰种子萌发，并提高种子的萌发率表2，为格力兜兰种子成苗及引种回归奠定基础，有利于格力兜兰的保育工作的开展。附图说明[0012]图1为本发明采用的格力兜兰成熟但未裂开的果荚示意。[0013]图2为格力兜兰种子播种于萌发培养基表面及暗培养示意。[0014]图3为格力兜兰种子开始萌发，形成白色原球茎示意。[0015]图4为格力兜兰种子在光照下培养，原球茎变为绿色示意。[0016]图5为格力兜兰原球茎转接后于光照下培养示意。具体实施方式[0017]下面用本发明的具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限制本发明。[0018]实施例1:本发明所述的格力兜兰种子非共生萌发的培养方法萌发培养基配制:准确称取Ig花宝1号粉末，用IL加热沸腾的蒸馏水溶解，再加入20g蔗糖和7g琼脂，超声溶解Ih，使琼脂完全溶解。将培养基分别取20ml倒入50ml三角瓶中，共设10个重复，用封口膜将三角瓶瓶口密封。[0019]培养基的消毒处理:将分装好的培养基置于高压灭菌锅中，于121°C灭菌20min，后置于超净工作台中自然冷却，备用;经过灭菌处理的培养基于3日内用完。[0020]格力兜兰果荚灭菌处理:新鲜采集成熟但未裂开的格力兜兰果荚1粒，用软毛刷蘸取洗衣粉清洗表面，后用大量自来水清洗干净。在无菌工作台中用蒸馏水清洗果荚表面，后用质量浓度为75%的酒精擦拭果荚表面30S。用10%的次氯酸钠浸泡消毒20min，再用大量灭菌蒸馏水冲洗干净。[0021]格力兜兰种子播种及非共生培养：用无菌剪刀将消过毒的果荚剪成两段，用无菌镊子夹着其中一段，轻轻的将种子播撒于种子萌发培养基表面，于25°C下暗培养至种子萌发，每粒种子播撒10瓶培养基。种子产生白色原球茎后，计算格力兜兰种子萌发率，并将其转移至光照下继续培养，待原球茎全变为绿色后，转接至格力兜兰原球茎转接培养基中继续光照培养。[0022]在超净工作台中将原球茎全变绿的格力兜兰种子萌发培养基用无菌小刀切成直径约5mm的琼脂块，用无菌镊子夹着转接到格力兜兰原球茎转接培养基中，每个培养基均匀的放4-5个琼脂块。转接完成后将其置于光照下培养，光照时间为12hd。[0023]实施例2:本发明所述的格力兜兰种子萌发培养方法萌发培养基配制:准确称取Ig花宝1号粉末，用IL加热沸腾的蒸馏水溶解，再加入20g蔗糖和7g琼脂作为基础培养基。在基础培养基中加入0.5g活性炭后，超声溶解1h，使琼脂完全溶解，活性炭均匀分散。将培养基分别取20ml倒入50ml三角瓶中，共设10个重复，用封口膜将三角瓶瓶口密封。[0024]培养基的消毒处理、格力兜兰果荚灭菌处理、格力兜兰种子播种及非共生培养、原球茎的转接及培养参照实施例1。[0025]实施例3:本发明所述的格力兜兰种子萌发培养方法萌发培养基配制:准确称取Ig花宝1号粉末，用IL加热沸腾的蒸馏水溶解，再加入20g蔗糖和7g琼脂作为基础培养基。在基础培养基中加入10g椰子粉后，超声溶解Ih，使琼脂完全溶解。将培养基分别取20ml倒入50ml三角瓶中，共设10个重复，用封口膜将三角瓶瓶口密封。[0026]培养基的消毒处理、格力兜兰果荚灭菌处理、格力兜兰种子播种及非共生培养、原球茎的转接及培养参照实施例1。[0027]实施例4:本发明所述的格力兜兰种子萌发培养方法萌发培养基配制:准确称取Ig花宝1号粉末，用IL加热沸腾的蒸馏水溶解，再加入20g蔗糖和7g琼脂作为基础培养基。在基础培养基中同时加入10g椰子粉和0.5g活性炭后，超声溶解Ih，使琼脂完全溶解，活性炭均匀分散。将培养基分别取20ml倒入50ml三角瓶中，共设10个重复，用封口膜将三角瓶瓶口密封。[0028]培养基的消毒处理、格力兜兰果荚灭菌处理、格力兜兰种子播种及非共生培养、原球茎的转接及培养参照实施例1。[0029]表1格力兜兰种子萌发培养基配方参照实施例1-4所述的格力兜兰萌发培养基配方及种子萌发培养方法，将消毒处理后得到的格力兜兰种子接种于萌发培养基后，分别进行培养。能观察到有白色原球茎出现时记录种子萌发率和萌发时间，结果如表2所示。[0030]表2格力兜兰种子萌发时间及萌发率对照组1为基础培养基，未添加椰子粉及碳粉，种子萌发时间长且萌发率比较低。实验组1添加了碳粉，实验组2椰子粉〇的培养基，能提高格力兜兰种子萌发率，并且缩短萌发所需的时间。同时添加碳粉及椰子粉的培养基实验组3能显著的缩短格力兜兰萌发所需的时间，并且明发率提尚的明显。[0031]以上所述实施例描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种格力兜兰种子非共生萌发的培养方法，步骤如下：1采集成熟但未裂开的格力兜兰果荚，用软毛刷蘸取洗衣粉清洗表面后自来水清洗，在无菌工作台用蒸馏水清洗果荚表面后，用质量浓度为70%-75%的酒精擦拭果荚表面20-30s，再用质量浓度5%-10%的次氯酸钠溶液浸泡消毒15-20min，灭菌蒸馏水冲洗干净，用无菌剪刀将果荚剪成两段，获得格力兜兰种子;其特征在于，还包括如下步骤：2用无菌镊子夹着包含格力兜兰种子的果荚，将种子播撒于种子萌发培养基表面，于25°C下暗培养至种子萌发，统计种子萌发率;种子萌发培养基产生白色原球茎后，将其转移至光照下继续培养，光照时间为12hd，待原球茎全变为绿色；所述的种子萌发培养基配方为：1gL的花宝1号、7gL琼脂、20gL蔗糖、0.5gL活性炭粉和10gL椰子粉；3在超净工作台中将原球茎全变绿的种子萌发培养基用无菌小刀切成直径约5mm的圆形琼脂块，用无菌镊子夹着琼脂块转接到格力兜兰原球茎转接培养基中，每个转接培养基均匀的放4-5个琼脂块，转接完成后置于光照下继续光照培养，光照时间为12hd;所述的格力兜兰原球茎转接培养基配方为：1gL花宝1号、7gL琼脂、20gL蔗糖、〇.5gL活性炭粉、10gL椰子粉、1.0mgL细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤6-BA和0.2mgL植物生长素萘乙酸NAA。2.根据权利要求1所述的一种格力兜兰种子非共生萌发的培养方法，其特征在于:步骤1中所述格力兜兰果荚表面的消毒方法为:先用质量浓度为75%酒精擦拭果荚表面，然后用质量浓度10%次氯酸钠溶液浸泡消毒20min，后用大量灭菌蒸馏水进行清洗。3.根据权利要求1所述的一种格力兜兰种子非共生萌发的培养方法，其特征在于:步骤2中所述格力兜兰种子暗培养萌发的时间为54天。

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