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申请/专利权人：中国农业科学院植物保护研究所

摘要：本发明属于农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因和应用。东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明克隆了东亚飞蝗的serpin1基因的cDNA，并通过连接，转化步骤将基因转入大肠单菌体内。通过饲喂serpin1纯化蛋白，绿僵菌侵染的蝗虫的死亡率大大降低，并测定蝗虫体内POD和SOD的酶活力，经serpin1处理后较绿僵菌的处理组相比，蝗虫体内的两者酶活力都降低到与对照无显著性差异，因此，serpin1基因能够作为负调控因子控制病菌的侵入引起的过度免疫反应。

主权项：1.东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

全文数据：东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因和应用技术领域本发明属于农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因和应用。背景技术丝氨酸蛋白酶抑制剂serpins蛋白家族是一个成员众多、分布广泛的蛋白酶抑制剂家族，能够抑制丝氨酸蛋白酶活性，参与调节生物体内多种生理反应，包括血液凝集、纤维蛋白溶解、补体激活、免疫黑化、生长发育过程中组织构建等。serpins蛋白家族中的Serpin-6与家蚕表皮黑化、蜕皮变态、先天性免疫等生理过程有关。烟草天蛾serpin3a可以与丝氨酸蛋白酶PAP1和PAP3形成共价复合物而抑制酚氧化酶原PPO的激活，烟草天蛾serpin4,5抑制PPO激活是通过抑制上游血淋巴蛋白酶而完成的。在革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染时，serpin又涉及不同的调节方式，只有革兰氏阳性菌感染时，serpin4与HP-21形成共价复合物，serpin_5与HP1和HP6结合成共价复合物来抵御感染；在革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染时，serpin4与血淋巴蛋白酶HP1和HP6形成共价复合物抑制PPO激活，烟草天蛾serpin6也可以通过调节PAP3和HP8来抑制PPO激活。发明内容本发明的目的在于提供一种东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1。本发明的再一目的在于提供上述东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1的基因。本发明的再一目的在于提供包含上述基因的重组表达载体。本发明的再一目的在于提供包含上述基因的重组菌株。本发明的再一目的在于提供包含上述基因的应用。本发明提供的东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示：上述蛋白的分子质量为46.9KD，等电点为6.51。本发明提供东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示：本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1的cDNA序列长度为1228bp，完整的开放阅读框长为1040bp，完整开放阅读框位于188-1228bp。本发明提供包含serpin1基因的重组表达载体，表达载体优选为pMD19-TVector载体。本发明提供包含丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1编码基因的重组菌株，重组菌株优选为大肠杆菌BL21。本发明还提供上述丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因的应用。绿僵菌的侵染能使蝗虫体内的酶发生一系列的变化，会导致蝗虫体内的保护酶的酶活性持续提高而导致蝗虫体内的过度免疫，导致蝗虫的死亡。本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1编码基因能够有效控制这种现象，通过对serpin1基因表达的蛋白与绿僵菌混合后的毒力测定，表明serpin基因能够有效降低绿僵菌的毒力。serpin1能有效抑制绿僵菌对蝗虫的侵染；绿僵菌侵染会造成蝗虫体内的保护酶的活力升高，丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1与绿僵菌混合处理后，蝗虫体内的POD和SOD酶活力下降，因此，本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1能够通过控制蝗虫体内蛋白酶的活性有效抑制绿僵菌侵染。附图说明图1显示Serpin1基因的SDS-PAGE电泳结果；图2显示serpin1的产物电泳分析结果；图3显示不同饵剂处理后东亚非蝗的死亡率情况；图4显示不同饵剂处理后POD酶活的变化情况；图5显示不同饵剂处理后SOD酶活的变化情况。具体实施方式供试绿僵菌菌株接种到添加马铃薯琼脂培养基PDAY平板上，25℃下培养14d。收集分生孢子粉，密封贮存于4℃冰箱，备用。东亚飞蝗卵采集于河北省沧州市，在人工气候培养箱中孵化温度30士2℃，相对湿度60士5％，光周期14L:10D.孵化后，将同一时问孵化的蝗蛹转移到60cmX50cmX70cm规格的养虫笼中饲养，光周期14L:10D，温度为30士2℃。实施例1克隆serpin1基因用trizol溶液提取东亚飞蝗中肠中的总RNA，反转录合成cDNA的一条链，并以此为模板进行PCR克隆，已去除信号肽的目的基因的引物序列为F:5'CGCGGATCCCATGGCAGAGGAAGTG3'下划线表示设计的BamHⅠ酶切位点；R:5'CCCAAGCTTAACGCCAACCACAGC3'下划线表示设计的HindⅢ酶切位点。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化，经分析其序列大小为1228bp，完整的开放阅读框长1040bp。实施例2构建重组表达载体将纯化产物连接到Pmd19-TVector载体，并将连接产物加入感受态细胞BL21中，将LB固体培养基上培养的阳性克隆菌株送去测序。将测序成功的重组基因提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切，将酶切的产物连接到PET-21b质粒载体中，即PET-21b-serpin1转入大肠杆菌BL21中，经过SDS-PAGE凝胶电泳验证，结果如图1所示。实施例3诱导重组蛋白表达取重组基因的单克隆接种于新鲜的LB含Amp培养液，震荡过夜，转接培养至OD值为0.5-0.6，然后加IPTG终浓度为0.5mmolL，27℃诱导过夜后，用5％浓缩胶和12％分离胶进行SDS-PAGE电泳分析蛋白样品。将诱导蛋白5OOOXg离心10min收集菌体。加入预冷的BindingBufferI重悬菌体，加入PMSF至终浓度0.25mgml。冰上超声裂解菌体300w，超声持续5s，暂停5s，重复99个循环。4℃,12000Xg，离心10min，回收上清。沉淀加入预冷的BindingBufferII重悬，4℃轻柔振荡1h以溶解包涵体。用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白，结果如图2所示。实施例4验证serpin1的功能4.1测定serpin1和绿僵菌混合后的毒力将预先饥饿了12h的东亚飞蝗3龄蝗蛹每15头放入无菌的塑料筐中，加入处理好的饵剂含有5％植物油的无菌麦麸5g，24h后将饵剂取出，以新鲜麦苗饲喂至实验结束，每日检测蝗虫的死亡率。试验在35℃,16L:8D下室内进行，重复五次。饵剂中绿僵菌和serpin1的浓度见下表：表1不同处理饵剂成分及浓度死亡率测定结果如表2，图3所示：表2Serpin1处理后东亚飞蝗的死亡率经绿僵菌处理后的第3天开始直到第8天，东亚飞蝗的死亡率显著高于对照P＜0.05，serpin1处理组与对照无显著差异P＞0.05，经过serpin1和绿僵菌混合处理后的死亡率在第三天和第四天与对照无显著差异P＞0.05，第五天至第八天与对照差异显著，与绿僵菌处理组相比其死亡率显著降低。4.2测定serpin1处理POD和SOD的酶活将3-4龄的蝗虫分装，每个处理3个重复，每筐装30头蝗虫，饥饿处理24小时。按照不同的处理，进行饲喂不同处理的饵剂，饵剂的浓度和组成如表1所示。饲喂24h后正常喂食无处理的饵剂，从第二天开始每组处理取3头，于液氮中研磨均匀，用POD试剂盒和SOD试剂盒分别测定POD和SOD的活性。Pod酶活结果如图4所示，总体呈先升高再降低的趋势。绿僵菌处理后第一天，东亚飞蝗体内的POD酶活力与对照无差异p＜0.05，处理第三天时，蝗虫体内的pod酶活力显著上升，第四天酶活力降低，与对照无显著差异。而serpin1与绿僵菌的混合处理后，蝗虫体内的酶活自第二天开始较绿僵菌处理组持续降低，且与对照组无显著性差异。绿僵菌处理后SOD酶活力结果如图5所示，总体呈先降低再升高再降低的趋势。绿僵菌处理后第一天，东亚飞蝗体内的SOD酶活力较对照显著上升p＞0.05，处理第二天时，蝗虫的酶活力显著下降，处理第三天时，蝗虫体内的SOD酶活力显著上升，第四天是酶活力降低，与对照无显著差异。而serpin1与绿僵菌的混合处理后，第一天蝗虫体内的酶活力较对照明显升高，但自第二天开始较绿僵菌处理组酶活力降低，且与对照组无显著性差异。4.3中肠提取液总可溶性蛋白含量测定参照Bradford方法测定，以0.1％的牛血清蛋白BSA为标准蛋白，检测纯化的serpin1蛋白的蛋白含量，用SDS-PAGE电泳检测serpin1蛋白和BSA的蛋白含量。根据两者蛋白条带对比测出serpin1蛋白含量，对比处理和对照均重复3次。实验结果表明serpin1的蛋白含量为0.7mgml。序列表中国农业科学院植物保护研究所东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因和应用2SIPOSequenceListing1.01363PRT东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis1MetGluThrAlaGlyGlyValAlaLeuAlaLeuHisAlaIleSerGly151015AlaAlaHisLeuProThrProAlaLeuThrLeuThrLeuAlaAlaGly202530ProGlyAlaLeuProProSerProLeuSerIleGlyValIleLeuAla354045LeuThrProLeuGlyAlaLeuAlaAlaThrAlaAlaGlyMetGluThr505560AlaLeuGlyLeuAlaIleProGlyAlaThrAlaValValGlyAlaGly65707580ValGlyAlaLeuMetGluThrAlaAlaLeuGlyGlyIleAlaAlaVal859095AlaLeuAlaValAlaAlaAlaIleThrLeuLeuAlaGlyThrProIle100105110LeuGlyGlyProAlaSerSerAlaSerAlaProLeuAlaGlyValGly115120125GlyValAlaProLeuGlyGlyProLeuAlaAlaLeuThrIleAlaAla130135140ThrValGlySerLeuThrAlaHisLeuIleLeuGlyIleIleProSer145150155160GlyIleLeuAlaGlyLeuThrAlaLeuValLeuValAlaAlaIleThr165170175ProAlaGlyAlaThrGlyThrLeuProLeuLeuHisAlaThrProPro180185190ValProProHisSerAlaAlaGlySerThrLeuAlaValAlaMetGlu195200205ThrMetGluThrSerLeuGlyGlyHisLeuLeuThrSerGlyAlaSer210215220AlaLeuAlaCysGlyValLeuLeuLeuProThrLeuGlyGlyAlaPro225230235240SerMetGluThrLeuIleLeuLeuProAlaGlyValAlaGlyLeuAla245250255SerLeuGlyGlyLeuLeuAlaAlaProSerLeuGlyAlaThrLeuAla260265270AlaLeuGlyGlyThrAlaValHisAlaGlyLeuProLeuProLeuIle275280285GlyThrSerLeuGlyLeuThrSerValLeuThrLeuLeuGlyMetGlu290295300ThrThrAlaMetGluThrProGlyAlaAlaAlaAlaProThrGlyIle305310315320ThrAlaAlaGlyHisLeuLeuValAlaLeuValLeuHisLeuAlaPro325330335ValGlyValAlaGlyGlyGlyThrGlyAlaAlaAlaAlaThrAlaVal340345350ValGlyValProThrSerLeuThrIleThrLeu35536021041DNA东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis2atggcagaggaagtgaatctagcattgcataatatatcgcaagcaaatcatctctttact60ttcgacttgtacaagactttggcagcggagcctgggaacttgttcttctctccgttgagt120atacaagtaattctggcgctcacgtttcttggagcgaaagacaatacggccaggcagatg180gccaaaggactgcgcataccagaggacacagctgtcgtcgaggatggtgtcggcgcttta240atgaacagattacaggaaatcaacgacgtgcggcttgatgtagccaacaggatatatctg300aaagctggatatcccatcaaggaaggttttaattcatcagcatctagattcaaggctgga360gtagaggaagtagatttcctagaagaaccgaaagcgagaaaaaccataaatgactgggta420gaaagcaagacaaatcataagataaaggaaataattccatctggtatattgaatggctta480actcgattggtgttggtcaatgctatttacttcagaggcgactggcagacaaagtttaaa540aagcatagaacgtttccagtgcctttccactcagctgacggatcaacgaagaatgttgac600atgatgtctctcgaggaacacttaaagtacagcgagagaagtgatttgaattgccaagtc660cttctccttccttataagggagagaggttcagcatgcttattttactacccagagaggta720aacggattggcaagtcttgaggaaaaacttgccgacttcagtcttcaagatactcttaac780aacctgcaaggaacaaatgtacacgcacaattaccaaaatttaaaattgaatactcaaaa840gaactgacgagtgtgctaacaaagctcggaatgacagacatgtttgaaaacgctgctaat900ttcactggcattactgacgcagagcatctgaaggtggacaaagtcctacataaggctttc960gttgaagtcaacgaggagggaacggaagctgctgctgctactgctgtggttggcgttcca1020tactcgctaacaatttggaag1041

权利要求：1.东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因，其特征在于，编码权利要求1所述的东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1。3.根据权利要求2所述的东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。4.包含东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因的重组表达载体。5.包含东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因的重组菌株。6.东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因的应用。

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