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申请/专利权人：中国药科大学

摘要：本发明涉及一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，包括如下步骤：步骤1，纳米Zn2Ph2Da材料制备；步骤2，荧光标记核酸适体吸附纳米Zn2Ph2Da。本发明的有益效果在于，首先，本发明纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法简单，制备过程不需要有毒有机溶剂，不需要严格的合成条件；其次，该纳米Zn2Ph2Da探针稳定性好，使用方便；此外，该纳米Zn2Ph2Da探针具有良好的核酸适配体结合能力，对mircoRNA有良好的选择性，其他生物分子及有机分子对其荧光信号无明显影响；最后，本发明方法为共性检测方法，适用于各种mircoRNA的选择性识别和检测。

主权项：1.一种检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1，纳米Zn2Ph2Da材料制备；步骤2，荧光标记核酸适体吸附纳米Zn2Ph2Da；步骤1包括如下步骤：步骤1.1，称取ZnAc2·2H2O、配体2,2’-二硫代水杨酸和辅助配体1,10-菲啰啉加入10-100mL极性有机溶剂中；步骤1.2，在步骤1.1的混合溶液中加入0.1-0.5mL氢氧化钠或氢氧化钾溶液，所述氢氧化钠或氢氧化钾溶液浓度为0.01-0.05gmL，混合均匀；步骤1.3，步骤1.2中的混合溶液转移至反应釜的聚四氟乙烯内胆中，封装反应釜，放入烘箱中，以150-220℃加热，反应20-70h；步骤1.4，将步骤1.3反应釜降温至室温，得到Zn2Ph2Da晶体；步骤1.5，将步骤1.4中得到的Zn2Ph2Da晶体1-10mg，加入1-10mL无水乙醇中，利用细胞破碎仪超声粉碎10-60min后，离心，得到纳米Zn2Ph2Da；步骤2包括如下步骤：步骤2.1，将0.010-0.150mg纳米Zn2Ph2Da分散于0.5-1.0mL浓度为0.01M的PBS中，pH7.4；步骤2.2，加入0.5-10μLTAMRA标记浓度为10-50μM的核酸适配体，室温下搅拌反应0.1-1h，在5000-12000rpm条件下离心，得到纳米Zn2Ph2Da探针；2,2’-二硫代水杨酸、1,10-菲啰啉和Zn离子的摩尔比例为1:2:2。

全文数据：一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法技术领域本发明属于microRNA荧光检测的技术领域，具体涉及一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法。背景技术MicroRNA是一类约18～25个碱基的单链小分子RNA，可通过各种途径参与生物体内发育、器官形成、造血过程、病毒防御、脂肪代谢等生理活动，其反常表达与癌症的引发、肿瘤的生成、肿瘤治疗的应激反应有关，是癌症处理的重要标志物和治疗靶分子。因此，实现对microRNA的高灵敏检测具有重要的科学意义。目前，检测mircoRNA的方法大致分为Northern印迹法、微阵列芯片技术、RT-PCR技术、核酸杂交扩增检测、纳米检测等。其中，基于纳米材料的mircoRNA荧光检测方法不仅操作简单，而且具有高灵敏度、高选择性的特点。这些纳米材料如金纳米颗粒、石墨烯和二硫化钼等具有很好的荧光猝灭能力，并能吸附荧光标记的核酸适配体，当加入与该适配体完全匹配的目标mircoRNA后，杂交形成结构稳定的双螺旋DNA结构，并从该纳米材料表面脱离，体系的荧光信号恢复。根据体系荧光强度的变化，可实现对mircoRNA的定量检测。纳米级金属有机配位材料可作为一种新型的传感材料，近年来在气体存储、催化和生物分子传感领域展现出一定潜力。本发明以2,2’-二硫代水杨酸和1,10-菲啰啉为配体，制备了新型的含锌离子的金属有机配位材料Zn2Ph2Da。该材料通过π-π键相互作用形成稳定的晶体结构。在有机相中，通过超声粉碎的方法，可以得到Zn2Ph2Da的纳米级颗粒。纳米Zn2Ph2Da可吸附荧光分子标记的核酸适配体，通过荧光强度的变化，对目标mircoRNA进行高灵敏、高选择性检测。发明内容1.要解决的技术问题为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，简化制备步骤，提高检测的稳定性，同时提高对mircoRNA的选择性。2.技术方案为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，包括如下步骤：步骤1，纳米Zn2Ph2Da材料制备；步骤2，荧光标记核酸适体吸附纳米Zn2Ph2Da。优选的是，步骤1包括如下步骤：步骤1.1，称取ZnAc·2H2O、配体2,2’-二硫代水杨酸和辅助配体1,10-菲啰啉加入10-100mL极性有机溶剂中；步骤1.2，在步骤1.1的混合溶液中加入0.1-0.5mL氢氧化钠或氢氧化钾溶液0.01–0.05gmL，混合均匀；步骤1.3，步骤1.2中的混合溶液转移至反应釜的聚四氟乙烯内胆中，封装反应釜，放入烘箱中，以150-220℃加热，反应20-70h；步骤1.4，将步骤1.3反应釜降温至室温，得到Zn2Ph2Da晶体；步骤1.5，将步骤1.4中得到的Zn2Ph2Da晶体1-10mg，加入1-10mL无水乙醇中，利用细胞破碎仪超声粉碎10-60min后，离心，得到纳米Zn2Ph2Da。优选的是，步骤2包括如下步骤：步骤2.1，将0.010-0.150mg纳米Zn2Ph2Da分散于0.5-1.0mLPBS0.01M，pH7.4中；步骤2.2，加入0.5-10μLTAMRA标记核酸适配体10-50μM，室温下搅拌反应0.1-1h，在5000-12000rpm条件下离心，得到纳米Zn2Ph2Da探针。优选的是，所述的Zn2Ph2Da晶体形貌为长方体。优选的是，2,2’-二硫代水杨酸、1,10-菲啰啉和Zn离子的摩尔比例为1:2:2。优选的是，ZnAc·2H2O的摩尔数为0.05-0.50mmol。优选的是，配体2,2’-二硫代水杨酸的摩尔数0.05-0.60mmol。优选的是，辅助配体1,10-菲啰啉的摩尔数为0.05-0.60mmol。3.有益效果综上所述，本发明的有益效果在于：1本发明所述的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法简单，制备过程不需要有毒有机溶剂，不需要严格的合成条件2本发明所述的纳米Zn2Ph2Da探针稳定性好，使用方便。3本发明所述的纳米Zn2Ph2Da探针具有良好的核酸适配体结合能力，对mircoRNA有良好的选择性，其他生物分子及有机分子对其荧光信号无明显影响。4本发明方法为共性检测方法，适用于各种mircoRNA的选择性识别和检测。附图说明图1为Zn2Ph2Da晶体图片。图2为Zn2Ph2Da的最简分子结构图。图3为Zn2Ph2Da材料与模拟XRD相图比较。图4为纳米Zn2Ph2Da探针检测mircoRNA示意图。图5为纳米Zn2Ph2Da探针与miR-2120nM作用后的荧光发射谱。其横坐标为波长nm，纵坐标为荧光强度。图6为纳米Zn2Ph2Da探针检测miR-21的线性关系。其横坐标为miR-21溶液浓度1-200nM，纵坐标为荧光强度变化F-F0，其中F0和F分别为纳米Zn2Ph2Da探针与miR-21反应前和反应后的荧光强度。图7为纳米Zn2Ph2Da探针对miR-21的选择性。其中，T1为错配RNA：5’-UAGCUCUUCAGACUGGAGUUGA-3’；T2为错配RNA：5’-UAGCAAAUCAGGCUGAUGAAGA-3’。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。实施例：如图1-7所示1.纳米Zn2Ph2Da探针制备步骤1，纳米Zn2Ph2Da材料制备：步骤1.1，称取ZnAc·2H2O0.2mmol，配体2,2’-二硫代水杨酸0.1mmol，辅助配体1,10-菲啰啉0.2mmol，加入20mL无水乙醇中；步骤1.2，加入0.120mL氢氧化钾溶液0.03gmL，搅拌均匀；步骤1.3，立即封装反应釜，放入烘箱中，以200℃加热，反应24h；步骤1.4，冷却至室温后用乙醇洗涤晶体三次，将乙醇倾出，挥干乙醇后，得到Zn2Ph2Da晶体如附图1所示，其形貌为长方体状；步骤1.5，取Zn2Ph2Da晶体5mg，加入2mL无水乙醇中，利用细胞破碎仪超声粉碎30min后，离心，得到纳米Zn2Ph2Da如附图2所示。制备得到的Zn2Ph2Da晶体与模拟的XRD谱图相如附图3所示，结果表明得到的Zn2Ph2Da晶体结构与模拟的衍射峰相符，证明所得的样品为纯相的Zn2Ph2Da晶体。步骤2，荧光标记核酸适体吸附纳米Zn2Ph2Da：步骤2.1，将0.050mg纳米Zn2Ph2Da分散于1mLPBS0.01M，pH7.4中；步骤2.2，加入2μLmiR-21的TAMRA标记核酸适配体TAMRA-P’，5’-TAMRA-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’25μM，室温下搅拌反应0.5h，然后在10000rpm下离心，得到核酸适配体修饰的纳米Zn2Ph2Da探针，将其分散于2mLPBS0.01M，pH7.4中，备用。2.纳米Zn2Ph2Da探针对mircoRNAmiR-21的荧光响应：取含有miR-21的血浆100μL，加入300μL纳米Zn2Ph2Da储备液中，反应5min后，观察荧光强度的变化，该过程如附图4所示；纳米Zn2Ph2Da探针加入含miR-21血浆后的荧光光谱图如附图5所示；纳米Zn2Ph2Da探针检测miR-21的线性关系如附图6所示。3.纳米Zn2Ph2Da探针对mircoRNAmiR-21的选择性：分别取含有50nM的miR-21、T1、T2、ATP、UTP、GTP、CTP、GSH和HSA的血浆样品100μL，加入300μL纳米Zn2Ph2Da储备液中，反应5min后，观察荧光强度的变化，如附图7所示。结果表明，纳米Zn2Ph2Da探针对mircoRNA的识别是通过吸附在其表面的核酸适体TAMRA-P对mircoRNA的选择性响应,；当没有mircoRNA时，吸附于纳米Zn2Ph2Da的TAMRA-P发生荧光猝灭；当处在含mircoRNA的环境中时，TAMRA荧光强度恢复。以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

权利要求：1.一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1，纳米Zn2Ph2Da材料制备；步骤2，荧光标记核酸适体吸附纳米Zn2Ph2Da。2.根据权利要求1所述的一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，其特征在于：步骤1包括如下步骤：步骤1.1，称取ZnAc·2H2O、配体2,2’-二硫代水杨酸和辅助配体1,10-菲啰啉加入10-100mL极性有机溶剂中；步骤1.2，在步骤1.1的混合溶液中加入0.1-0.5mL氢氧化钠或氢氧化钾溶液0.01-0.05gmL，混合均匀；步骤1.3，步骤1.2中的混合溶液转移至反应釜的聚四氟乙烯内胆中，封装反应釜，放入烘箱中，以150-220℃加热，反应20-70h；步骤1.4，将步骤1.3反应釜降温至室温，得到Zn2Ph2Da晶体；步骤1.5，将步骤1.4中得到的Zn2Ph2Da晶体1-10mg，加入1-10mL无水乙醇中，利用细胞破碎仪超声粉碎10-60min后，离心，得到纳米Zn2Ph2Da。3.根据权利要求1所述的一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，其特征在于：步骤2包括如下步骤：步骤2.1，将0.010-0.150mg纳米Zn2Ph2Da分散于0.5-1.0mLPBS0.01M，pH7.4中；步骤2.2，加入0.5-10μLTAMRA标记核酸适配体10-50μM，室温下搅拌反应0.1-1h，在5000-12000rpm条件下离心，得到纳米Zn2Ph2Da探针。4.根据权利要求2所述的一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，其特征在于：所述的Zn2Ph2Da晶体形貌为长方体。5.根据权利要求2所述的一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，其特征在于：2,2’-二硫代水杨酸、1,10-菲啰啉和Zn离子的摩尔比例为1:2:2。6.根据权利要求2所述的一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，其特征在于：ZnAc·2H2O的摩尔数为0.05-0.50mmol。7.根据权利要求2所述的一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，其特征在于：配体2,2’-二硫代水杨酸的摩尔数0.05-0.60mmol。8.根据权利要求2所述的一种可检测mircoRNA的纳米Zn2Ph2Da探针的制备方法，其特征在于：辅助配体1,10-菲啰啉的摩尔数为0.05-0.60mmol。

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