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申请/专利权人：宁夏医科大学

摘要：本发明公开了一种生物合成Hispidin的方法。本发明提供了一种生物合成Hispidin的方法，包括如下步骤：以火木层孔菌培养液的上清液作为生物合成体系，在所述生物合成体系中加入4‑羟基‑6‑甲基‑2‑吡喃酮或4‑羟基‑6‑甲基‑2‑吡喃酮和3,4‑二羟基苯甲醛进行反应，即得到Hispidin。本发明提供的hispidin的生物合成方法，污染少，得率高，得到最大产量的hispidin，浓度为25.86mgL。

主权项：1.一种生物合成Hispidin的方法，包括如下步骤：用火木层孔菌的培养液或其培养液的上清液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮，得到Hispidin；所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为0.5mgmL；所述火木层孔菌的培养液为培养火木层孔菌得到的培养液；培养时间为15天；反应的时间为60小时。

全文数据：一种生物合成Hispidiη的方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种生物合成Hispidin的方法。背景技术[0002]Hispidin6_[⑹_2_3,4-dihydroxyphenylethenyl]-4-hydroxypyran-2-〇ne化合物结构见式1是真菌中常见的具有抗氧化作用的多酚类化合物，于1961年首次从粗毛黄褐孔菌PolyporushispidusBull.:Fr分离得到。研究表明，hispidin广泛存在于药食两用菌中，具有抗糖尿病、抗病毒以及抗A549，SCL-l，Bel7402和Capan-I等肿瘤细胞活性，并有大量研究集中在抗肿瘤和抗氧化作用机制方面。以hispidin为关键前体物质合成的衍生物在大型药用真菌中普遍存在，大部分具有较强的抗氧化、抗炎以及抗肿瘤等活性。鉴于hispidin衍生物结构独特及较强的抗氧化活性，这类成分一直吸引众多研究者们的关注，并有学者认为hispidin衍生物是药用真菌中抗氧化作用最重要的药效物质基础。[0004]火木层孔菌Phellinusigniarius属担子菌亚门、多孔菌科、木层孔菌属，又称鲍氏层孔菌。其子实体一一桑黄是我国传统药用真菌，味甘、辛、无毒，寄生于桑、柳、桦及杨等树的树干上，为多年生。桑黄除了具有传统的治疗淋病、崩漏、带下、排毒、和胃止泻等功效外，还具有抗癌、抗脂质过氧化、免疫调节、保肝、抗肝硬化和抗诱变等药用功能。发明内容[0005]本发明的一个目的是提供一种生物合成Hispidin的方法。[0006]本发明提供的方法，包括如下步骤：用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-轻基-6-甲基-2-R比喃酮，得到Hispidin;[0007]或用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3，4-二羟基苯甲醛，得到Hispidin。[0008]上述方法包括如下步骤:向火木层孔菌的培养液或其培养液的上清液中加入4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮或4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3，4_二羟基苯甲醛进行反应，得到Hispidin。[0009]上述方法中，所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为0.02_0.5mgmL；[0010]或，所述4-轻基-6-甲基-2-R比喃酮在其所在体系中的浓度为0.5mgmL或0.ImgmL〇[0011]上述方法中，所述3，4-二羟基苯甲醛在其所在体系中的浓度为0.lmgmL。[0012]上述方法中，所述火木层孔菌的培养液为培养火木层孔菌得到的培养液；[0013]所述培养时间为15-25天。[0014]上述方法中，所述火木层孔菌的培养液为培养火木层孔菌得到的培养液；[0015]所述培养时间为15天到20天。[0016]上述方法中，所述反应的时间为20小时-10天。[0017]上述方法中，所述反应的时间为60小时。[0018]上述方法还包括如下步骤：[0019]若采用火木层孔菌的培养液的上清液，则将所述反应的产物用乙酸乙酯萃取，得至丨JHispidin;[0020]若采用火木层孔菌的培养液，则先将所述反应的产物过滤菌丝体，再用乙酸乙酯萃取，得到Hispidin。[0021]由上述方法制备的Hispidin也是本发明保护的范围。[0022]本发明提供hispidin的生物合成方法，该方法污染少，得率高。附图说明[0023]图1为培养后的TLC分析结果。[0024]图2为hispidin的HPLC图谱。[0025]图3为hispidin的NMR图谱。[0026]图4为Hispidin标准曲线。[0027]图5为4-羟基-6-甲基吡喃酮标准曲线。具体实施方式[0028]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0029]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0030]下述实施例中Hispidin的生物合成过程如下：[0032]实施例1、生物合成Hispidin[0033]采用培养火木层孔菌20天的液体培养液作为生物催化体系，加入4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4_二羟基苯甲醛继续培养24h，经分离纯化和NMR鉴定后，得到活性化合物hispidin，且从1HNMR谱中质子积分可知transcishispidin各占50%;具体见下面描述。[0034]一、生物合成方法[0035]1、生物合成体系的制备[0036]采用液体马丁培养基【葡萄糖（20gL、蛋白胨+酵母粉7gL、磷酸氢二钾（lgL、无水硫酸镁0.5gL，pH自然】30°C摇床震荡培养火木层孔菌（中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCCNO.5.9520天，培养液离心常温4000rpm离心15分钟）后，取培养液上清20mL分装到50mL锥形瓶中作为生物合成体系。[0037]2、生物合成[0038]实验分为如下几组：[0039]实验组:含有上述1得到的20mL生物合成体系内投入2mL原始溶液浓度为lmgmL的前体化合物:4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3，4-二羟基苯甲醛，使4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3，4-二羟基苯甲醛在培养液中的终浓度均达到约0.1mgmL;[0040]菌液对照组:含有上述1得到的20mL生物合成体系培养液；[0041]菌液加4-羟基-6-甲基-吡喃酮对照组：向含有上述1得到的20mL生物合成体系内投入2mL原始溶液浓度为lmgmL的前体化合物4-羟基-6-甲基-吡喃酮，使4-羟基-6-甲基-吡喃酮在培养液中的终浓度达到约〇.lmgmL;[0042]菌液加3,4_二羟基苯甲醛对照组：向含有上述1得到的20mL生物合成体系内投入4mL原始溶液浓度为lmgmL的前体化合物3，4-二羟基苯甲醛，使3，4-二羟基苯甲醛在培养液中的终浓度达到约0.lmgmL;[0043]将上述各组在摇床培养继续反应10天，收集培养液。[0044]乙酸乙酯常温萃取培养液体积比1:1三次，收集乙酸乙酯萃取产物，浓缩后检测。[0045]3、检测[0046]ITCL检测[0047]TCL检测上述2得到的乙酸乙酯萃取产物，结果如图1展开剂石油醚：丙酮=5:3所示，图IA提示实验组除去原始菌液里面主要成分和投入的底物，实验组内有明显的hispidin斑点；图IB提示菌液+4-轻基-6-甲基-卩比喃酮对照组中也有hispidin产生，说明火木层孔菌培养体系中能够提供3,4_二羟基苯甲醛;图IC说明仅向菌液中投入3,4_二羟基苯甲醛时，没有hispidin产生。[0048]2HPLC-DAD检测[0049]取2mL甲醇溶解上述2得到的乙酸乙酯萃取物，再用ImL注射器吸取0.ImL的样品，并甲醇稀释至lmL，0·22μηι的滤膜过滤样品。安捷伦1220，AgilengtXDB-C18分析柱，流动相：20%-70%甲醇（0·2%甲酸水梯度洗脱25min，254nm检测。[0050]结果如图2所示，A为4-轻基-6-甲基-卩比喃酮8.2min和hispidin18.5min标准品的HPLC图谱;B为3，4-二羟基苯甲醛的HPLC图谱8.Omin;C为菌液对照组的HPLC图谱;D为菌液加3，4-二羟基苯甲醛对照组的HPLC图谱;E为菌液加4-羟基-6-甲基-吡喃酮对照组；F为实验组HPLC图谱;G为实验组HPLC图谱与4-羟基-6-甲基-吡喃酮和hispidin标准品色谱峰对照图谱。[0051]检测结果表明：当投入化合物为4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4_二羟基苯甲醛时，有hispidin产生（图2E，仅投入4-羟基-6-甲基-吡喃酮时也有hispidin产生，且产量和实验组相似图2F。其他对照组中未检测到hispidin。[0052]3NMR鉴定[0053]采用SephadexLH-20柱层析凝胶柱柱子高度30cm，直径1.5cm对上述2得到的实验组的乙酸乙酯萃取物进行分离，洗脱剂为纯甲醇。[0054]实验组的结果的NMR鉴定结果如图3所示，transcis-hispidin的匪R图谱；（a1H匪R⑹13CWR;，在4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛的生物合成脱水的过程中分别形成了顺式和反式双键，因此产生trans-Hispidin6-[E-2-3,4-dihydroxyphenylethenyl]-4-hydroxypyran_2-〇ne及cis-Hispidin6_[Z-2-3，4_dihydroxyphenylethenyl]-4-hydroxypyran_2-〇ne两个化合物。且从1HNMR中质子积分来看，两个化合物各占50%。[0055]二、生物合成条件优化[0056]由于上述实验证实，在火木层孔菌培养体系中仅加入4-羟基-6-甲基-吡喃酮，也会有hispidin产生，且不影响产率，说明火木层孔菌培养体系中能够提供3,4_二羟基苯甲醛。因此，以火木层孔菌培养时间㈧、4-羟基-6-甲基-吡喃酮投入量⑻和投入之后反应时间（C三个影响因素，各设三个水平优化培养条件。[0057]1、优化[0058]采用马丁液体培养基、30°C摇床震荡培养火木层孔菌不同时间A，收集培养液，取含有菌丝体的培养液作为生物合成体系。向含有培养不同时间的生物合成体系内投入不同终浓度⑻的前体化合物4-羟基-6-甲基-吡喃酮，继续摇床震荡培养进行反应不同时间C，收集反应产物。八层纱布过滤反应产物的菌丝体，1:1乙酸乙酯萃取培养液三次，收集乙酸乙酯萃取物，合并萃取液浓缩成浸膏状，用于后期检测。[0059]通过L934正交表设计实验。[0060]表1三个因素和三个水平[0062]表2L934正交表[0064]表3实验设置分组[0066]2、HPLC检测[0067]①标准曲线的绘制[0068]分别取浓度0.015625,0.03125,0.0625,0.125,0.25,0.5,lmgmL的Hispidin和浓度分别为〇.125，0.3125，0.5，2，8mgmL的4-羟基-6-甲基吡喃酮进行标准曲线的绘制。[0069]③液相分析[0070]分别采用2mL甲醇溶解样品，从中吸取0.ImL用甲醇稀释至ImUO.22μπι的滤膜过滤样品至液相小瓶。安捷伦1220，AgilengtXDB-Cl8分析柱，液相条件:20%-70%甲醇0.2%甲酸水梯度洗脱25min，254nm〇[0071]通过HPLC测定，Hispidin和4-羟基-6-甲基吡喃酮的标准曲线见图4和图5。根据标准曲线，计算得出9组实验中hispidin的含量见表4。[0072]表4各组中hispidin的含量单位:mgL[0074]因此，由hispidin产量可知，最佳组合条件是Al，B3，C3组3，即在火木层孔菌培养15天时的培养液作为生物合成的酶体系、投入4-羟基-6-甲基吡喃酮的终浓度为0.5mgmL、继续反应时间为60h时，得到最大产量的hispidin，浓度为25.86mgL。[0075]通过极差计算可知，影响hispidin产量的的因素最重要的是底物浓度，其次是投入培养周期，最后是反应时间。

权利要求：1.一种生物合成Hispidin的方法，包括如下步骤：用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-轻基-6-甲基-2-卩比喃酮，得到Hispidin;或用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4_二羟基苯甲醛，得到Hispidin。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：向火木层孔菌的培养液或其培养液的上清液中加入4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮或4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛进行反应，得到Hispidin03.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为〇.02-0.5mgmL;或，所述4-轻基-6-甲基-2-P比喃酮在其所在体系中的浓度为0.5mgmL或0.lmgmL。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述3,4_二羟基苯甲醛在其所在体系中的浓度为〇.lmgmL。5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述火木层孔菌的培养液为培养火木层孔菌得到的培养液；所述培养时间为15-25天。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述培养时间为15天到20天。7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于:所述反应的时间为20小时-10天。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述反应的时间为60小时。9.根据权利要求2-8中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：若采用火木层孔菌的培养液的上清液，则将所述反应的产物用乙酸乙酯萃取，得到Hispidin;若采用火木层孔菌的培养液，则先将所述反应的产物过滤菌丝体，再用乙酸乙酯萃取，得到Hispidin。10.由权利要求1-9任一所述方法制备的Hispidin。

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