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申请/专利权人：杭州文德阶生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种米诺巴林的高效生物合成方法及突变体，首先利用重组羰基还原酶突变体选择性还原消旋体EHEO中的S‑EHEO，获得ee值高达99.8％的R‑EHEO。其次，经过几步化学修饰后获得CEHEC；然后，通过定向进化获得的腈水解酶突变体对CEHEC进行水解，一步将其立体拆分为S‑CEHEA，ee值高达99％，最后通过催化加氢还原获得米洛巴林。本发明采用酶法替代了两个关键中间体的合成，大大降低了工艺步骤和生产成本，酶法温和的反应条件使操作过程更加简单，对环境更加友好，符合绿色工业生产的要求，解决了已有的工艺中产物ee值不高，反应条件剧烈，反应过程较为复杂且难以控制，对环境不够友好等问题。

主权项：1.一种米诺巴林的高效生物合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：11R,5S-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮的制备：以含羰基还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为催化剂，以3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮为底物，以有机醇为反应介质构成反应体系，在200-300rpm，20℃条件下反应完全后，反应液分离纯化，获得1R,5S-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮，简称R-EHEO；所述羰基还原酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；21R,5S-6-氰甲基-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-腈制备：R-EHEO和氰乙酸乙酯以六氢吡啶作为催化剂，在正己烷中，加热回流通过Knoevenagel反应获得中间体后，将该中间体在乙醇、氰化钾水溶液中升温回流，获得1R,5S-6-氰甲基-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-腈，简称CEHEC；32-1R,5S,6S-6-氰基-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基乙酸的制备：以含腈水解酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为催化剂，以CEHEC为底物，pH＝8的Tris-HCl缓冲液为反应介质，在300rpm，30℃条件下反应12h，反应液经分离纯化后获得2-1R,5S,6S-6-氰基-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基乙酸，简称S-CEHEA；所述腈水解酶突变体编码基因核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；4米诺巴林的制备:S-CEHEA催化加氢，获得米诺巴林。

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