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申请/专利权人：遵义医科大学附属医院;中国医学科学院肿瘤医院

摘要：本发明涉及生物技术领域，公开了长链非编码RNAs中CCAT2、LINC00511和LINC01133在结直肠癌诊断领域的新应用。本发明发现了CCAT2、LINC00511和LINC01133在结直肠癌血清中表达上升，是潜在结直肠癌诊断标志物，与CEA以及CA19‑9联合作为肿瘤标志物共同诊断，具备更强的特异性和灵敏度，故本发明提供了CCAT2、LINC00511和LINC01133三者以及三者和CEA以及CA19‑9联合在结直肠癌诊断领域的新应用，从而为该领域的疾病提供了新的诊断方法，也补充了CCAT2、LINC00511和LINC01133三者的研究成果。

主权项：1.CCAT2、LINC00511、LINC01133、CEA和CA19-9作为结直肠癌联合诊断标志物在制备结直肠癌诊断试剂或试剂盒中的应用。

全文数据：长链非编码RNAs的应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及长链非编码RNAs的应用。背景技术[0002]结直肠癌colorectalcancer，CRC是男性第三大癌症，也是女性第二大癌症，约占全球每年癌症发病率的10%。每年约有120万新发病例和60万患者死亡，结直肠癌也是致死率第四大最常见的肿瘤。发病率在50岁以下人群中较低，但随着年龄增加而显著提高。发达国家中，结直肠癌患者确诊时年龄中位数在70岁左右。结直肠癌发病率随着经济发展水平的不断提高呈现强有力的正向梯度。结直肠癌在欧洲、北美和大洋洲发病率最高，而在南亚、中亚和非洲一些国家发病率最低。我国结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势。2011年，我国结直肠癌的发病率和死亡率分别为23.0310万和11.1110万。CRC的最重要预后因素是病人确诊时疾病所处阶段。美国2001至2007年确诊为结直肠癌的患者中，原位癌患者5年生存率为90.1%，区域淋巴结转移患者5年生存率为69.2%，远端转移患者5年生存率仅11.7%。目前，在加拿大、澳大利亚、美国和欧洲等一些高收入国家中，结直肠癌患者5年生存率已经接近65%，而我国仅为47.2%。之前的大量研究已经发现，结直肠癌家族史、炎症性肠道疾病、吸烟、过度饮酒等不良生活方式以及肥胖、糖尿病等疾病状态均可能促进结直肠癌的发生。健康的生活方式，如不吸烟不饮酒，合理膳食等是结直肠癌防控的重要手段。[0003]结直肠癌筛查旨在通过早期检测和检测相关并发症的发生率来降低结直肠癌死亡的风险。这种筛查还旨在通过检测和去除癌前病变来降低结直肠癌的发病率和死亡率。结直肠癌患者就诊时大多已处于中晚期，疗效较差，除早期诊断争取手术根治外，目前尚无有效的非手术治疗手段。因此，结直肠癌的早期诊断与早期治疗是非常重要的。[0004]目前，临床上常用的结直肠癌筛查方法包括粪便隐血试验、内镜和CT结肠成像这三种筛查方法。粪便隐血检测包括愈创木脂化学法粪便潜血试验（guaiacF0BT，gF0BT和更敏感的粪便免疫化学检测FIT。使用光学纤维内镜直接检查直肠和结肠的方法包括乙状结肠镜检查和结肠镜检查。结肠镜检查既作为主要筛查工具，也作为对其他筛查方法检测呈阳性者的随访。此外，计算机断层扫描CT结肠成像技术已被开发为一种结肠直肠癌筛查的微创可视化技术。最近出现但尚未广泛测试的新技术是基于视觉检查例如，视频胶囊内窥镜检查）或粪便中的生物标志物（例如多靶标DNA，血液中（例如甲基化septin9DNA或呼吸中（例如挥发性有机化合物和蛋白质的各种标志物，RNA和DNA中生物标记物的分析。[0005]虽然粪便隐血试验简便易行，价格低廉，但对于早期结直肠癌的诊断效率低，敏感性差。内窥镜检查的诊断准确率高，但可能会产生心理危害以及乙状结肠镜检查阳性结果后不必要的转诊。此外，内镜检查可能会引发严重的医疗伤害，其中最常见的是出血和穿孔，尽管此类不良事件不常见，每次事件发生率为结肠镜检查的0.01-0.05%，但内镜筛查癌症过度诊断的比例不确定。与CT结肠成像相关的潜在危害包括辐射诱发效应、结肠外发现检测的下游效应以及后续结肠镜检查的潜在损害。临床上常用的血清肿瘤标志物有蛋白质类肿瘤标志物CEA，糖原类肿瘤标志物CA19-9、CA242与CA50。这些标志物对大肠癌诊断的敏感性与特异性较差，所以亟需发现新的肿瘤标志物用于大规模的结直肠癌早期诊断。发明内容[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供长链非编码RNAs中CCAT2、LINC00511和LINC01133在结直肠癌诊断领域的新应用。CCAT2、LINC00511和LINC01133的序列依次如SEQIDNo.1-3所示（IncRNA通用的序列表达方法在本领域以DNA的序列来表示）。[0007]本发明检测了CCAT2、LINC00511和LINC01133在结直肠癌CRC与正常对照者血清中的含量，发现血清中CCAT2、LINC00511和LINCOl133在CESC血清中均明显升高，且差异显著，这表明了CCAT2、LINC00511和LINC01133三者可联合作为诊断结直肠癌的潜在肿瘤标志物。[0008]同时，本发明还将上述三个长链非编码RNAs与CEA以及CA19-9联合作为肿瘤标志物，通过受试者工作特征曲线ROC方法分析其诊断效率，结果显示，由CCAT2、LINC00511、LINCOl133与CEA以及CA19-9联合组成的CRC诊断模型的诊断效率较高，AUC值可达到为0.911，敏感性与特异性更强;与单个临床上结直肠癌的血清标志物CEA以及CA19-9相比，其联合本发明所述三个长链非编码RNAs作为肿瘤标志物共同诊断，具备更强的特异性和灵敏度。[0009]以上试验结果表明，CCAT2、LINC00511和LINC01133可以作为结直肠癌的联合肿瘤标志物，更为优选地方案，CCAT2、LINC00511、LINC01133和CEA以及CA19-9可以作为结直肠癌的联合肿瘤标志物;并且可通过能够检测各自的表达量的诊断试剂，比如引物、探针等，或整套试剂盒，比如扩增体系、引物、探针、酶等，对结直肠癌进行诊断。[0010]因此，本发明提出了CCAT2、LINC00511和LINC01133作为结直肠癌诊断标志物在制备结直肠癌诊断试剂和或试剂盒中的应用，以及CCAT2、LINC00511、LINC01133和SCC作为结直肠癌诊断标志物在制备结直肠癌诊断试剂和或试剂盒中的应用。[0011]作为优选，所述试剂或试剂盒包括至少包括CCAT2、LINC00511和LINC01133扩增试剂，或CCAT2、LINC00511、LINC01133和CEA以及CA19-9的扩增试剂，并可根据实际情况选择包括或不包括血清总RNA提取试剂和长链非编码RNAs逆转录试剂；[0012]其中，所述〇^了2上預：00511和1^預：01133扩增试剂包括^厶了2、1^預：00511和LINC01133扩增上下游引物、SYBRPremixExTaqII2x和ROXReferenceDye50X中的一种或两种以上；[0013]其中，所述CCAT2扩增上下游引物序列如SEQIDNo.4-5所示，所述LINC00511扩增上下游引物序列如SEQIDNo.6-7所示，所述LINC01133扩增上下游引物序列如SEQIDNo.8-9所示。[00M]CEA以及CA19-9的扩增试剂可采用本领域常规的试剂盒市售试剂盒；[0015]由以上技术方案可知，本发明发现了CCAT2、LINC00511和LINC01133在结直肠癌血清中表达上升，是潜在结直肠癌诊断标志物，与CEA以及CA19-9联合作为肿瘤标志物共同诊断，具备更强的特异性和灵敏度，故本发明提供了〇^了2丄預00511和1^1%01133三者以及三者和CEA以及CA19-9联合在结直肠癌诊断领域的新应用，从而为该领域的疾病提供了新的诊断方法，也补充了CCAT2、LINC00511和LINC01133三者的研究成果。附图说明[0016]图1所示为CCAT2、LINC00511和LINC01133在结直肠癌患者和正常人血清中含量对比结果；纵坐标为CCAT2、LINC00511和LINC01133的相对表达量，横坐标normal为正常人血清，colorectalcancer为结直肠癌血清;A-C依次为CCAT2、LINC00511和LINCOl133结果；[0017]图2所示为0^了2、1^%00511和1^%01133单独作为诊断标志物的1?0：曲线分析;八为CCAT2的ROC曲线;B为LINC00511的ROC曲线；C为LINCOl133的ROC曲线;纵坐标为灵敏性，横坐标为特异性；[0018]图3所示为CCAT2、LINC00511、LINC01133和CEA以及CA19-9作为诊断标志物的R0C曲线分析;A为CAl9-9的ROC曲线;B为CEA的ROC曲线;C为CCAT2、LINC00511、LINCO1133、CEA以及CAl9-9联合后的ROC曲线;纵坐标为灵敏性，横坐标为特异性。具体实施方式[0019]本发明公开了长链非编码1?嫩8中0^了2、1^]00511和1^1%01133的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0020]本发明通过从患者血清或者血浆中提取RNA，利用POlyA加尾法逆转录，反转录〇0嫩，然后再通过实时定量?0?反应扩增0^2、1^00511和1^01133并检测其在血清中的含量，与正常血清相比，相对含量高于正常血清值即可诊断为结直肠癌，其中所涉及的步骤如下CEA以及CA19-9检测采用本领域常规方法）：[0021]A.血清总RNA的提取[0022]1取-80°C冰箱保存的血清250mL，加入750mlTrizolLS，取移液器将其混匀，于室温放置5分钟裂解。[0023]2加入200yL三氯甲烷，加速RNA相的分离，来回摇晃EP管15秒，室温静止15分钟后，于12000rpm离心10分钟。[0024]3取上清液体400yL加入等体积异丙醇，室温静置10分钟后，12000rpm离心10分钟。[0025]4加入用1?他86-;1^6去离子水配制的预冷75%乙醇清洗沉淀，8000印1]1离心5分钟后，室温晚干。[0026]5加26yLRNase-free的水溶解沉淀，-80°C保存。[0027]B.长链非编码RNAs的逆转录[0028]cDNA第一条链的合成按照ReverseTranscriptaseM-MLVforFirstStrandcDNA试剂盒说明书进行。具体操作如下：[0029]1.取用RNasefree的PCR管，依次加入下列试剂：[0030]DNA-freeTotalRNA12yL[0031]Randomprimer25μηι2yL[0032]混匀并离心。[0033]2.70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min以上，离心数秒。[0034]3.在上述PCR管中配制下列反转录反应液：[0035]上述模板RNA引物变性溶液HyL[0036]5XM-MLVBuffer4yL[0037]dNTPsIOmMIyL[0038]RnaseInhibitor40UyL0.5yL[0039]RnaseM-MLVRnaseH—0.5yL[0040]RnasefreeddH20补足至IOyL[0041]30°C孵育10分钟后，42°C保温一小时。[0042]4.70°C保温15min后冰上冷却，灭活逆转录酶。[0043]5.向cDNA产物中添加RNaseFreeddH20补足至100ul，存于-20°C或者-80°C冰箱中，备用。取2ul稀释液进行下一步RealtimePCR反应。[0044]C.实时定量PCR反应[0045]以上述cDNA为模板，用SYBR®PremixExTaqTM试剂盒TakaRa，在ViiATM7荧光定量PCR仪AppliedBiosystems上进行操作。以GAI3DH为内参GAPDH上下游引物如SEQIDNo.10-11所示），定量方法选用2-ΔACt法。具体操作如下：[0046]1反应体系[0047]表1[0048][0049]2RT_qPCR引物[0050]表2[0051][0052]3反应条件:95°C预变性30秒，然后95°C15秒，60°C30秒，45个循环；[0053]4融解曲线反应:在上述循环结束后，进行融解曲线绘制，条件为95°C15秒，60°C1分钟，95°C15秒。每个样品均重复三次取平均值，以保证定量精确。[0054]以下就本发明所提供的长链非编码RNAs中CCAT2、LINC00511和LINC01133的应用做进一步说明。[0055]实施例1:实时定量PCR对血清noncodingRNA的水平检测[0056]血清样本来自于96例结直肠癌患者和100例正常对照者，所有研究对象均为汉族且无直系亲属关系。结直肠癌患者为2016年至2017年在中国医学科学院肿瘤医院进行治疗的患者。患者的纳入标准是以病理检查为依据。全部的结直肠癌样本均经组织病理学或细胞学确认，采血前未经放疗、化疗及手术治疗法;既往有其它肿瘤病史的患者排除在外。正常对照者随机选自同一时期在我院进行体格检查的正常人群。正常对照组纳入标准为:无肿瘤病史和临床体征，性别和年龄与结直肠癌组匹配。每个研究对象均签订知情同意书。经问卷或病历记录提供详细的人口学资料。[0057]随机选取30例正常健康人血清和30例结直肠癌患者血清进行了筛选试验。与正常对照组相比，CCAT2、LINC00511和LINCO1133在结直肠癌患者血清中明显升高，且差异显著。为了进一步验证其结果的可靠性，本发明进一步扩大了样本量，又随机选取70例正常对照与66例结直肠癌患者血清进行了检测，得到了相似的结果。[0058]与正常对照组相比，CCAT2、LINC00511和LINC01133平均升高的倍数分别为1.53、1.67与4.14倍。秩和检验计算出此3种长链非编码RNAs的表达差异，p值分别为0.008、0.000与0.000。数据经内参校正后的相对表达水平作图（见图1。[0059]实施例2:3种长链非编码RNAs作为结直肠癌血清标志物的ROC分析[0060]分别按照结直肠癌患者与正常人血清中实时定量PCR的结果，根据-ΛΛCt求值并做起相应的ROC曲线，观察曲线下面积及95%置信区间的范围来确定其灵敏性和特异性；ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间，在AUOO.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5〜0.7时有较低准确性;AUC在0.7〜0.9时有一定准确性;AUC在0.9以上时有较高准确性;AUC=O.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值;AUCXO.5不符合真实情况，在实际中极少出现。[0061]如图2所示，0^了2丄預00511和1^預01133的厶1]：值分别为0.603、0.672、0.713。本发明还分析了目前临床上常用来作为结直肠癌诊断的血清标记物CA19-9与CEA的曲线下面积，AUC值分别为0.70395%可信区间IC:0.641-0.765与0.82995%可信区间IC:0.781-0.877。本发明联合3种长链非编码RNAs与CA19-9、CEA绘制ROC曲线，敏感性与特异性分别为77.2%与92.9%，约登指数为0.701，并且AUC值达到了0.91195%可信区间IC:0.87-0.951，见图3。研究结果表明，与单个临床上结直肠癌的血清标志物相比，与多个长链非编码RNAs的联合诊断效率更高，敏感性与特异性更强。因此，基于联合三种长链非编码RNAs与CAl9-9、CEA建立的诊断模型对CRC有较高的诊断价值。[0062]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.0^12上預00511和1^預01133作为结直肠癌诊断标志物在制备结直肠癌诊断试剂和或试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述：0412、1^預00511和1^1叱01133序列如SEQIDNo.1-3所示。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒至少包括CCAT2、1^預〇0511和1^預〇1133扩增试剂。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述〇^12、1^預〇0511和1^預〇1133扩增试剂包括CCAT2、LINC00511和LINC01133扩增上下游引物、SYBRPremixExTaqII2x和ROXReferenceDye50x中的一种或两种以上。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述CCAT2扩增上下游引物序列如SEQIDNo.4-5所示。6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述LINC00511扩增上下游引物序列如SEQIDNo.6-7所示。7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述LINC01133扩增上下游引物序列如SEQIDNo.8-9所示。8.根据权利要求1-7任意一项所述应用，其特征在于，在宫颈癌诊断标志物中还包括结直肠癌血清标志物CEA以及CA19-9。

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