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申请/专利权人：遵义医科大学附属医院;中国医学科学院肿瘤医院

摘要：本发明涉及生物技术领域，公开了长链非编码RNAs中CCAT2、LINC00511和LINC01133在宫颈癌诊断领域的新应用。本发明发现了CCAT2、LINC00511和LINC01133在宫颈癌血清中表达上升，是潜在宫颈癌诊断标志物，与鳞癌抗原SCC联合作为肿瘤标志物共同诊断，具备更强的特异性和灵敏度，故本发明提供了CCAT2、LINC00511和LINC01133三者以及三者和SCC联合在宫颈癌诊断领域的新应用，从而为该领域的疾病提供了新的诊断方法，也补充了CCAT2、LINC00511和LINC01133三者的研究成果。

主权项：1.CCAT2、LINC00511和LINC01133作为宫颈癌诊断标志物在制备宫颈癌诊断试剂或试剂盒中的应用。

全文数据：长链非编码RNAs的应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及长链非编码RNAs的应用。背景技术[0002]根据国家癌症中心2016年发表于《临床医师肿瘤杂志》（CA:ACancerJournalforClinicians的数据显示，在我国宫颈癌是第二大女性恶性肿瘤。2015年我国宫颈癌新发及死亡病例数分别为9.89万例及3.05万例。20年来我国发病率和死亡率呈逐年升高趋势，而且日趋年轻化。既往研究已经证实，高危型人乳头瘤病毒Hr-HPV的持续感染是宫颈癌的主要病因。目前已识别的人乳头瘤病毒HPV已超过100种。30〜40种HPV与外生殖器感染相关，其中43种具有致癌风险（即Hr-HPV。目前已确认的14种Hr-HPV为HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73。其中，冊¥16和18是世界范围内最为重要的两种此-HPV。与世界卫生组织WHO国际癌症研究署（IARC等国际组织合作完成的《中国妇女HPV感染状态以及中国子宫颈癌HPV基因型别分布多中心研究》提供了我国部分地区的HPV感染情况感染率约为14%。在HPV病毒持续感染后，正常的宫颈上皮细胞可能转变为低度鳞状上皮内病变LSIL，继而转变成为高度鳞状上皮内病变HSIL，最终发展成为癌症。[0003]宫颈癌是严重威胁女性生命与健康安全的主要疾病，可以通过有效的前期筛查进行早期干预，提早预防。流行病学数据表明，通过筛查可以大大降低宫颈癌的发病率和死亡率。宫颈癌患者的预后与肿瘤的临床分期密切相关，因此宫颈癌的早期诊断与早期治疗至关重要。目前，临床上常用薄层液基细胞学LBC、HPVDNA检测技术第二代杂交捕获技术，HC2来诊断早期宫颈癌。但是影像学检查费用高，辐射量较大，并不适用于宫颈癌的早期筛查工作。我们需要诊断效率、敏感性与特异性更高的检查手段，以避免不必要的影响学检查。发明内容[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供长链非编码RNAs中CCAT2、LINC00511和LINCOl133在宫颈癌诊断领域的新应用。CCAT2、LINC00511和LINCOl133的序列依次如SEQIDNo.1-3所示（IncRNA通用的序列表达方法在本领域以DNA的序列来表示）。[0005]本发明检测了CCAT2、LINC00511和LINC01133在宫颈鳞癌CESC与正常对照者血清中的含量，发现血清中CCAT2、LINC00511和LINC01133在CESC血清中均明显升高，且差异显著，这表明了CCAT2、LINC00511和LINC01133三者可联合作为诊断宫颈癌的潜在肿瘤标志物。[0006]同时，本发明还将上述三个长链非编码RNAs与鳞癌抗原（SCC联合作为肿瘤标志物，通过受试者工作特征曲线ROC方法分析其诊断效率，结果显示，由CCAT2、LINC00511、LINC01133与鳞癌抗原（SCC联合组成的CESC诊断模型的诊断效率较高，AUC值可达到为0.940，敏感性与特异性更强;相比灵敏度较差的单一鳞癌抗原SCC标志物，其联合本发明所述三个长链非编码RNAs作为肿瘤标志物共同诊断，具备更强的特异性和灵敏度。[0007]以上试验结果表明，CCAT2、LINC00511和LINC01133可以作为宫颈癌的联合肿瘤标志物，更为优选地方案，〇^了2丄預00511、1^預01133和30：可以作为宫颈癌的联合肿瘤标志物;并且可通过能够检测各自的表达量的诊断试剂，比如引物、探针等，或整套试剂盒，比如扩增体系、引物、探针、酶等，对宫颈癌进行诊断。[0008]因此，本发明提出了CCAT2、LINC00511和LINC01133作为宫颈癌诊断标志物在制备宫颈癌诊断试剂和或试剂盒中的应用，以及《^了2丄預00511、1^預01133和30：作为宫颈癌诊断标志物在制备宫颈癌诊断试剂和或试剂盒中的应用。[0009]作为优选，所述试剂或试剂盒包括至少包括CCAT2、LINC00511和LINC01133扩增试剂，或CCAT2、LINC00511、LINC01133和SCC的扩增试剂，并可根据实际情况选择包括或不包括血清总RNA提取试剂和长链非编码RNAs逆转录试剂；[0010]其中，所述CCAT2、LINC00511和1^頂01133扩增试剂包括0^丁2、1^預：00511和LINC01133扩增上下游引物、SYBRPremixExTaqII2x和ROXReferenceDye50X中的一种或两种以上；[0011]其中，所述CCAT2扩增上下游引物序列如SEQID如.4-5所示，所述1^預〇0511扩增上下游引物序列如SEQIDNo.6-7所示，所述LINC01133扩增上下游引物序列如SEQIDNo.8-9所示。[0012]SCC的扩增试剂可采用本领域常规的试剂盒市售试剂盒；[0013]由以上技术方案可知，本发明发现了CCAT2、LINC00511和LINC01133在宫颈癌血清中表达上升，是潜在宫颈癌诊断标志物，与鳞癌抗原（SCC联合作为肿瘤标志物共同诊断，具备更强的特异性和灵敏度，故本发明提供了CCAT2、LINC00511和LINC01133三者以及三者和SCC联合在宫颈癌诊断领域的新应用，从而为该领域的疾病提供了新的诊断方法，也补充了CCAT2、LINC00511和LINC01133三者的研究成果。附图说明[0014]图1所示为CCAT2、LINC00511和LINC01133在宫颈鳞癌患者和正常人血清中含量对比结果；纵坐标为CCAT2、LINC00511和LINC01133的相对表达量，横坐标normal为正常人血清，CESC为宫颈鳞癌血清;A-C依次为CCAT2、LINC00511和LINCOl133结果；[0015]图2所示为0^了2丄預00511、1^預01133和50：作为诊断标志物的1?0：曲线分析;八为CCAT2的ROC曲线;B为LINC00511的ROC曲线;C为LINCOl133的ROC曲线;D为SCC的ROC曲线；E为CCAT2、LINC00511、LINC01133与SCC联合后的ROC曲线;纵坐标为灵敏性，横坐标为特异性。具体实施方式[0016]本发明公开了长链非编码RNAs中CCAT2、LINC00511和LINC01133的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0017]本发明通过从患者血清或者血浆中提取RNA，利用POlyA加尾法逆转录，反转录cDNA，然后再通过实时定量PCR反应扩增CCAT2、LINC00511和LINCO1133并检测其在血清中的含量，与正常血清相比，相对含量高于正常血清值即可诊断为宫颈癌，其中所涉及的步骤如下SCC检测采用本领域常规方法）：[0018]A.血清总RNA的提取[0019]1取-80°c冰箱保存的血清250mL，加入750mlTrizolLS，取移液器将其混匀，于室温放置5分钟裂解。[0020]2加入200yL三氯甲烷，加速RNA相的分离，来回摇晃EP管15秒，室温静止15分钟后，于12000rpm离心10分钟。[0021]3取上清液体400yL加入等体积异丙醇，室温静置10分钟后，12000rpm离心10分钟。[0022]4加入用RNase-free去离子水配制的预冷75%乙醇清洗沉淀，8000印111离心5分钟后，室温晚干。[0023]5加26yLRNase-free的水溶解沉淀，-80°C保存。[0024]B.长链非编码RNAs的逆转录[0025]cDNA第一条链的合成按照ReverseTranscriptaseM-MLVforFirstStrandcDNA试剂盒说明书进行。具体操作如下：[0026]1.取用RNasefree的PCR管，依次加入下列试剂：[0027]DNA-freeTotalRNA12yL[0028]Randomprimer25μηι2yL[0029]混匀并离心。[0030]2.70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min以上，离心数秒。[0031]3.在上述PCR管中配制下列反转录反应液：[0032]上述模板RNA引物变性溶液HyL[0033]5XM-MLVBuffer4yL[0034]dNTPsIOmMIyL[0035]RnaseInhibitor40UyL0.5yL[0036]RnaseM-MLVRnaseH—0.5yL[0037]RnasefreeddH20补足至IOyL[0038]30°C孵育10分钟后，42°C保温一小时。[0039]4.70°C保温15min后冰上冷却，灭活逆转录酶。[0040]5.向cDNA产物中添加RNaseFreeddH20补足至IOOul，存于-20°C或者_80°C冰箱中，备用。取2ul稀释液进行下一步RealtimePCR反应。[0041]C.实时定量PCR反应[0042]以上述cDNA为模板，用SYBR⑧PremixExTaqTM试剂盒TakaRa，在ViiATM7荧光定量PCR仪AppliedBiosystems上进行操作。以GAPDH为内参GAHH上下游引物如SEQIDNo.10-11所示），定量方法选用2-ΔACt法。具体操作如下：[0043]1反应体系[0044]表1[0046]2RT_qPCR引物[0047]表2[0049]3反应条件:95°C预变性30秒，然后95°C15秒，60°C30秒，45个循环；[0050]4融解曲线反应:在上述循环结束后，进行融解曲线绘制，条件为95°C15秒，60°C1分钟，95°C15秒。每个样品均重复三次取平均值，以保证定量精确。[0051]以下就本发明所提供的长链非编码RNAs中CCAT2、LINC00511和LINC01133的应用做进一步说明。[0052]实施例1:实时定量PCR对血清noncodingRNA的水平检测[0053]血清样本来自于115例宫颈鳞癌CESC患者和101例正常对照者，所有研究对象均为汉族且无直系亲属关系。宫颈鳞癌患者为2016年至2017年在中国医学科学院肿瘤医院进行治疗的患者。病人的纳入标准是以病理检查为依据。全部的样本均经组织病理学或细胞学确认，采血前未经放疗、化疗及手术治疗法;既往有其它肿瘤病史的患者排除在外。正常对照者随机选自同一时期在中国医学科学院肿瘤医院进行体格检查的正常人群。正常对照组纳入标准为:无肿瘤病史和临床体征，性别和年龄与宫颈鳞癌组匹配。每个研究对象均签订知情同意书。经问卷或病历记录提供详细的人口学资料。[0054]随机选取30例正常健康人血清和30例CESC患者血清进行了筛选试验。与正常对照组相比，CCAT2、LINC00511和LINC01133在CESC血清中明显升高，且差异显著。为了进一步验证其结果的可靠性，本发明进一步一步扩大了样本量，又随机选取71例正常对照与85例CESC患者血清进行了检测，得到了相似的结果。[0055]与正常对照组相比，0^了2丄預00511和1^預01133平均升高的倍数分别为2.70、1.57与3.15倍。秩和检验计算出此3种长链非编码RNAs的表达差异，P值分别为O.OOO、0.005与0.000。数据经内参校正后的相对表达水平作图（见图1。[0056]实施例2:3种长链非编码RNAs作为CESC血清标志物的ROC分析[0057]分别按照宫颈鳞癌癌患者与正常人血清中实时定量PCR的结果，根据-AAct求值并做起相应的ROC曲线，观察曲线下面积及95%置信区间的范围来确定其灵敏性和特异性；ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间，在AUOO.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5〜0.7时有较低准确性;AUC在0.7〜0.9时有一定准确性;AUC在0.9以上时有较高准确性;AUC=O.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值;AUCXO.5不符合真实情况，在实际中极少出现。[0058]如图2所示，CCAT2、LINC00511和1^1【01133的八1]：值分别为0.789、0.615、0.806;而联合3种长链非编码RNAs与SCC绘制ROC曲线，敏感性与特异性分别为81.6%与97.1%，约登指数为〇.787，并且AUC值达到了0.9495%可信区间IC:0.907-0.972。本发明还分析了目前临床上常用来作为宫颈癌诊断的血清标记物SCC的曲线下面积，AUC值为0.75695%可信区间IC:0.688-0.824，敏感性与特异性分别为52.6%与90.4%，约登指数为0.430。研究结果表明，与SCC相比，多个长链非编码RNAs与SCC的联合诊断效率更高，敏感性与特异性更强。虽然SCC作为宫颈鳞癌诊断的特异性比较高，但是灵敏度太差，尤其是对早期宫颈癌的诊断。因此，基于三种长链非编码RNAs与SCC联合建立的诊断模型的诊断价值高于SCC对宫颈鳞癌的诊断。[0059]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.CCAT2、LINC00511和LINC01133作为宫颈癌诊断标志物在制备宫颈癌诊断试剂和或试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述：0412、1^預00511和1^1叱01133序列如SEQIDNo.1-3所示。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒至少包括CCAT2、1^預〇0511和1^預〇1133扩增试剂。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述〇^12、1^預〇0511和1^預〇1133扩增试剂包括CCAT2、LINC00511和LINC01133扩增上下游引物、SYBRPremixExTaqII2x和ROXReferenceDye50x中的一种或两种以上。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述CCAT2扩增上下游引物序列如SEQIDNo.4-5所示。6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述LINC00511扩增上下游引物序列如SEQIDNo.6-7所示。7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述LINC01133扩增上下游引物序列如SEQIDNo.8-9所示。8.根据权利要求1-7任意一项所述应用，其特征在于，在宫颈癌诊断标志物中还包括鳞癌抗原。

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