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申请/专利权人：武田药品工业株式会社

摘要：本文描述的是结合血浆激肽释放酶pKal和因子XII的双特异性抗体以及生产这类双特异性抗体的方法和使用这类双特异性抗体治疗与接触系统相关的疾病或病症例如遗传性血管性水肿和血栓形成的方法。本公开的一个方面是双特异性抗体，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含第一抗体的轻链，所述轻链包含轻链可变区VL和轻链恒定区CL例如κ轻链或λ轻链；所述第二多肽包含第一抗体的重链，所述重链包含重链可变区VH和重链恒定区CH。

主权项：1.一种双特异性抗体，其包含：第一多肽，其包含第一抗体的轻链，所述轻链包含轻链可变区VL和轻链恒定区CL；和第二多肽，其包含第一抗体的重链，所述重链包含重链可变区VH和重链恒定区CH，其中所述第一多肽或所述第二多肽进一步包含第二抗体，所述第二抗体是包含重链可变区VH和轻链可变区VL的单链抗体，并且融合至所述第一多肽或所述第二多肽的C-末端；和其中所述第一抗体结合活性血浆激肽释放酶pKal并且包含HYIMM所示的重链互补决定区HCDR1、GIYSSGGITVYADSVKG所示的HCDR2和RRIGVPRRDEFDI所示的HCDR3；以及RASQSISSWLA所示的轻链互补决定区LCDR1、KASTLES所示的LCDR2和QQYNTYWT所示的LCDR3；并且其中所述第二抗体结合活性因子XII并且包含重链和轻链，所述重链包含：SEQIDNO:132所示的HCDR1、SEQIDNO:133所示的HCDR2和SEQIDNO:134所示的HCDR3；以及所述轻链包含：SEQIDNO:131所示的LCDR1、SEQIDNO:36所示的LCDR2和SEQIDNO:37所示的LCDR3。

全文数据：针对血浆激肽释放酶和因子X11的双特异性抗体[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求美国临时申请第62099,236号2015年1月2日提交）、美国临时申请第62200,363号（2015年8月3日提交和美国临时申请第62261，609号2015年12月1日提交）的申请日的权益。这些引用的申请的全部内容通过引用并入本文。[0003]发明背景[0004]因子XIIFXII是将前激肽释放酶转变成血浆激肽释放酶pKal的主要激活因子。激活的血浆激肽释放酶裂解（切割，cleave高分子量激肽原（HMWK，以释放缓激肽BKAKal也能将潜伏因子XII激活成为活性因子XII因子XIIa。在与接触系统的异常激活相关的疾病状态诸如遗传性血管性水肿）中，BK的不受控制的水平可引起患者疾病发作。[0005]发明概述[0006]本公开的一个方面是双特异性抗体，其包含:第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含第一抗体的轻链，所述轻链包含轻链可变区（Vl和轻链恒定区（α例如κ轻链或λ轻链），所述第二多肽包含第一抗体的重链，所述重链包含重链可变区（Vh和重链恒定区（Ch。所述双特异性抗体的第一多肽或第二多肽进一步包含第二抗体，所述第二抗体为单链抗体并且可被融合至第一多肽或第二多肽的C-末端。第一抗体和第二抗体中的一个结合血浆激肽释放酶（PKal例如活性pKal并且另外一个抗体结合因子XII例如活性因子XII或FXIIa，例如，第一抗体结合pKal且第二抗体结合FXIIa或反之亦然。[0007]在一些实施方案中，第一抗体是IgG。在一个实施例中，IgG包含突变的重链，所述突变的重链与野生型对应物相比，C-末端赖氨酸残基被缺失或突变。例如，第一抗体突变的重链可包含C-末端甘氨酸残基，而不是如在野生型IgG重链中的赖氨酸残基。在一个实施例中，双特异性抗体可以是四价的。[0008]在一些实施方案中，在双特异性抗体中的第二多肽包含第一抗体的重链和第二抗体之间的肽连接体。在一个实施例中，肽连接体可为SGGGSSEQIDN0:22。[0009]在第二抗体其为scFv抗体）中，Vh可被融合至Vl的N-末端。可替代地，Vh被融合至Vl的C-末端。在一些实施例中，第二抗体包含Vh区和Vl区之间的肽连接体，例如G4S4的连接体SEQIDN0:23。在一些实施方案中，scFv抗体包含在Vh链和Vl链之间形成的二硫键。例如，Vh链可包含在位置44C44处的半胱氨酸残基，和Vl链可包含在位置100处的半胱氨酸残基，其中二硫键可在Vh中的C44和Vl中的C10q之间形成。在一些实施例中，第二抗体在其C-末端不包含KR基序。[0010]在本文描述的任何双特异性抗体中，第一抗体的Vh具有与SEQIDNO:1中的互补决定区（CDR相同的互补决定区（CDR。在一些实施例中，第一抗体的Vh包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。在一个实施例中，第一抗体的重链包含SEQIDN0:9的残基20-470的氨基酸序列。在一个实施例中，第一抗体的重链包含SEQIDN0:9、149和150的氨基酸序列。可替代地或另外，第一抗体的Vl具有与SEQIDN0:2中的⑶R相同的⑶R。在一些实施例中，第一抗体的Vl包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。[0011]进一步地，第二抗体的Vh可具有与SEQIDN0:3、4和123-126中的任一个的⑶R相同的⑶R。在一些实施例中，第二抗体的Vh包含SEQIDN0:3、4和123-126的氨基酸序列中的任一种。可替代地或另外，第二抗体的Vl具有与SEQIDNO:5-8和127-130的任一个中的⑶R相同的⑶R。在一些实施例中，第二抗体的Vl包含SEQIDN0:5-8和127的氨基酸序列中的任一个的残基1-111。在一个实施例中，第二抗体的Vl包含SEQIDN0:5-8和127-130的氨基酸序列中的任一种。[0012]在一些实施例中，本文所述的的双特异性抗体包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQIDN0:10的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQIDN0:ll-20、47-122、141-148和151-158的氨基酸序列中的任一种。[0013]在另一个方面中，本公开提供了双特异性抗体，其包含结合至血浆激肽释放酶pKal的第一抗体和结合至因子XII的第二抗体，例如结合至活性pKal的第一抗体和或结合至活性因子XIIFXIIa的第二抗体。在一些实施方案中，第一抗体包含Vh链和或Vl链，所述Vh链包含与SEQIDNO:1中的互补决定区（CDR相同的互补决定区（CDR，所述Vl链包含与SEQIDN0:2中的CDR相同的⑶R。例如，第一抗体的Vh包含SEQIDNO:1的氨基酸序列，和或第一抗体的Vl包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。[0014]可替代地或另外，第二抗体包含Vh链和或Vl链，所述Vh链包含与SEQIDNO:3或4中的⑶R相同的⑶R，所述Vl链包含与SEQIDNO:5、6、7或8中的CDR相同的⑶R。例如，第二抗体的Vh链包含SEQIDNO:3或4的氨基酸序列;和或第二抗体的Vl包含SEQIDNO:5、6、7或8的氨基酸序列。[0015]可替代地或另外，第二抗体包含Vh链和或Vl链，所述Vh链包含与SEQIDNO:123-126任一个中的⑶R相同的⑶R，所述Vl链包含与SEQIDNO:127中的⑶R相同的⑶R。例如，第二抗体的Vh链包含SEQIDNO:123-126的任一氨基酸序列；和或第二抗体的Vl包含SEQIDNO:5-8和127的氨基酸序列中的任一个的残基1-111。[0016]在另一方面中，本公开提供了分离的核酸或核酸组，其包含编码本文所述的第一多肽或第一抗体的第一核苷酸序列和编码本文所述的第二多肽或第二抗体的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列位于两个分开的核酸分子上例如两个载体，诸如表达载体）。可替代地，第一核酸核苷酸序列和第二核酸核苷酸序列位于一个核酸分子上例如载体，诸如表达载体）。[0017]本文所述的核酸或核酸组可以是包含第一载体和第二载体的载体组，所述第一载体包含第一核苷酸序列，所述第二载体包含第二核苷酸序列。在一些实施例中，第一载体和第二载体是表达载体，其中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可操作地与启动子连接。在其他实施例中，本文所述的核酸是包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列两者的载体。本文所述的任何载体可以是表达载体。例如，表达载体可包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其可操作地与启动子连接。包含本文所述的载体或载体组的宿主细胞也在本公开的范围内。[0018]进一步地，本公开提供了包含本文所述的任何双特异性抗体或核酸核酸组和药学上可接受的载体的组合物。这类组合物可用于治疗与接触激活系统相关的疾病例如遗传性血管性水肿HAE或血栓形成）。本文所述的治疗方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的药物组合物。本公开也提供了用于治疗本文所述疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包含本文所述的任何双特异性抗体或编码所述双特异性抗体的核酸核酸组，和药学上可接受的载体，以及提供了这类药物组合物在制备用于治疗诸如HAE或血栓形成的这类疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，血栓形成与心房纤维颤动、深部静脉血栓形成DVT、肺栓塞、中风或动脉或静脉血栓形成事件相关。[0019]在又一方面中，本公开的特征在于制备双特异性抗体的方法，所述方法包括：（a在允许第一多肽和第二多肽表达的条件下培养本文所述的宿主细胞或宿主细胞组;和b分离包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体。在一些实施例中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一核苷酸序列和编码第二多肽的第二核苷酸序列。[0020]在下面的说明中阐释了本公开的一个或多个实施方案的细节。通过以下附图和对几个实施方案的详细说明，以及通过附加的权利要求书，本公开的其他特征或优点将是显而易见的。[0021]附图简述[0022]以下附图组成本说明书的一部分，并且被包括以进一步证明本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个结合对本文所示的具体实施方案的详细说明，可以更好地理解本公开。[0023]图1是显示各种双特异性抗体克隆抑制pKal的活性的图，所述克隆包括克隆120-AOlscFv=559C-M184-B04H4L、X121-E01scFv=559C-M184-G03H4L、X122-A01scFv=559C-M71-F06H4L*X122-C01scFv=559C-M71-F06L4H。[0024]图2包括的图显示克隆X120-A01A和B、X122-A01⑹、X121-E01⑼、X122-C01⑹和对照克隆M71-F06IgGF的FXIIa抑制活性。[0025]图3包括的图显示5种示例性双特异性分子的分析尺寸排阻色谱（SEC踪迹。前面的峰显示这些克隆具有高分子量聚集体，范围是％腿胃16.5-33.8^:62014136-^1^:6201-父136-〇5。：：6201-父136-605。0:6201-父136-012]\«184-804、6201-父0173-厶11、6201-父0173-〇7、6201-父0173407或6201-X0173-G11中那些⑶R相同的三个⑶R，和或如这些克隆中的那些⑶R相同的三个⑶R。见如下表1:[0126]表1:抗FXIIa克隆的CDR序列：[0127][0128][0129]可替代地，相比克隆559〇]\«071冲06、559：-]\«179-004、559：-]\«181-：02、559：-10180-603、559]\«184-804、6201-父0173-厶11、6201-父0173-〇7、6201-父0173407或6201-X0173-G11中的任一个，抗FXIIa部分在上文表1中所列出的一个或多个重链和或轻链⑶R中可包括一个或多个例如多达2、3、4、5、6、7或8个突变。这类突变可以是本文所述的保守的氨基酸取代。[0130]在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体中的抗FXIIa部分是IgG分子，其可以是天然存在的IgG或突变体，例如包含一个或多个例如1、2、3、4、5或更多个突变或缺失，例如以降低双特异性抗体的蛋白水解裂解、降低双特异性抗体的电荷异质性、和或改善双特异性抗体的表达、生产和或制造。在一些实施方案中，与其野生型对应物相比，IgG的重链的C-末端赖氨酸残基被去除或突变。在一些实施方案中，IgG重链C-末端赖氨酸被突变为中性氨基酸残基，例如甘氨酸残基或丙氨酸残基。[0131]双特异性抗体中的抗FXIIa部分可以是任何抗体形式，包括但不限于完整的（即全长抗体、其抗原结合片段诸如Fab、Fab’、Fab’）2、Fv和单链抗体。在一些实施例中，本文所述的抗PKal部分的重链可变区与重链恒定区（Ch连接，所述重链恒定区可以是重链恒定区的全长或其部分（例如Ch1、Ch2、Ch3或其组合）。重链恒定区可来源于本领域已知的任何Ch。在一些实施方案中，Ch是γ重链。可替代地或另外，抗pKal部分的轻链可变区与轻链恒定区（Cl连接，所述轻链恒定区可以是本领域已知的任何Cl。在一些实施例中，Cl是κ轻链。在其他实施例中，α是λ轻链。抗体重链和轻链恒定区在本领域内是熟知的，例如本文所述的。[0132]可替代地，本文所述的双特异性抗体中的抗FXIIa部分可以是单链抗体，在所述单链抗体中，重链可变区和轻链可变区例如通过柔性flexible肽连接体诸如GGGGS4的连接体SEQIDNO:23被融合。重链可变区和轻链可变区可在H—L方向上融合或可在L—H方向上融合。在一些实施方案中，ScFv的轻链部分在其C-末端不包含KR基序。[0133]在一些实施方案中，抗FXIIa部分是包含SEQIDN0:3或SEQIDN0:4的重链可变区和或SEQIDN0:5-8任一个的轻链可变区的scFv。在一个实施例中，抗FXIIa部分是在H—L或L—H方向上包含SEQIDNO:3的重链可变区和SEQIDNO:5-8任一个的轻链可变区的scFv抗体。在其他实施例中，抗FXIIa部分是在H—L或L—H方向上包含SEQIDN0:4的重链可变区和SEQIDNO:5的轻链可变区的scFv抗体。在一些实施方案中，抗FXIIa部分是包含SEQIDNO:123-126任一个的重链可变区和或SEQIDNO:127-130任一个的轻链可变区的scFv。在一个实施例中，抗FXIIa部分是在H—L或L—H方向上包含SEQIDNO:123的重链可变区和SEQIDNO:127的轻链可变区的scFv抗体。在一个实施例中，抗FXIIa部分是在H—L或L—H方向上包含SEQIDNO:123的重链可变区和SEQIDNO:127的轻链可变区的scFv抗体。在另一个实施例中，抗FXIIa部分是在H—L或L—H方向上包含SEQIDNO:124的重链可变区和SEQIDNO:128的轻链可变区的scFv抗体。在另一个实施例中，抗FXIIa部分是在L或L—H方向上包含SEQIDNO:125的重链可变区和SEQIDNO:129的轻链可变区的scFv抗体。在另一个实施例中，抗FXIIa部分是在H—L或L—H方向上包含SEQIDNO:126的重链可变区和SEQIDNO:130的轻链可变区的scFv抗体。[0134]在一些实施方案中，本文所述的任何scFv抗体的重链可变区和轻链可变区例如通过诸如Vh残基44和VU00残基之间的二硫键被进一步连接。[0135]iii抗pKal抗FXII双特异性抗体的形式[0136]本文所述的抗pKal抗FXIIa双特异性抗体可以为本领域已知的任何双特异性抗体形式，例如在Klein等，mAbs46:653-663,2012;Kontermann等，mAbs42:182_197，2012;和Coloma等，NatureBiotechnology15:159-163，1997中所述的那些双特异性抗体形式。在一些实施例中，双特异性抗体可以是杂交全长抗体也称为四价体瘤quadroma或三官能抗体），其包含与PKal结合的一个臂（重链轻链复合体和与FXII结合的另一个臂重链轻链复合体）。在一些实施例中，双特异性抗体是双特异性Fab’2或三-Fab分子，所述双特异性Fab’2包含与pKal结合的一个Fab片段和与FXII结合的另一个Fab片段，所述三-Fab分子包含与一个靶抗原例如pKal或FXIIa结合的Fab片段的两个拷贝和与另一靶抗原例如FXIIa或pKal结合的Fab片段的一个拷贝。可替代地，双特异性抗体是串联的scFv分子，其包含与pKal结合的scFv的至少一个拷贝和与FXIIa结合的另一个scFv的一个拷贝。本文所述的双特异性抗体也可以是本领域已知的双抗体或单链双抗体。其他实例包括但不限于IgG2、Fab’）2、CovX_体、scFvdg、IgG-scFv、scFv_IgG、DVD_Ig、IgG-sVD、sVD-IgG、二合一型IgG2-in-l_IgG、mAb2、串联抗体共同（TandemabcommonLC、kihIgG、kihIgG共同LC、CrossMab、kihIgG-scFab、mAb_Fv、电荷对、SEED-体、双抗体（Db、dsDd、scDb、tandAbs、串联scFv、三联抗体（triplebody、Fab_scFv和Fab，）2-scFv2。见，例如，Kontermann等，mAbs42:182-197,2012的图2。[0137]在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体的支架被设计成包含IgG抗体部分和scFv部分，所述scFv部分被融合至IgG部分的重链或轻链的C-末端（例如IgG的重链的C-末端，见例如Coloma?M.J.Morrison?S.L.Designandproductionofnoveltetravalentbispecificantibodies.NatureBiotechnology·152:159-163·1997〇IgG重链或轻链可通过短肽连接体诸如富含甘氨酸残基和丝氨酸残基的肽与scFv融合。在一个实施例中，肽连接体包含SGGGS的氨基酸序列SEQIDNO:22。[0138]这类双特异性抗体可包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含第一抗体的轻链，所述轻链包含轻链可变区π和轻链恒定区（α;所述第二多肽包含融合蛋白，其从N-末端至C-末端包含第一抗体的重链，所述重链包含重链可变区Vh、重链恒定区（Ch和第二抗体，所述第二抗体可以是单链抗体。可替代地，双特异性抗体可包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含第一抗体的重链，所述重链包含重链可变区（Vh和重链恒定区（Ch或其部分;所述第二多肽包含融合蛋白，其从N-末端至C-末端包含第一抗体的轻链和第二抗体，所述轻链包含轻链可变区Vl和轻链恒定区（Cl，所述第二抗体是单链抗体。在一些实施例中，第一抗体可结合至PKal例如活性pKal和第二抗体可结合至FXII例如FXIIa。在其他实施例中，第一抗体可结合至FXIIa和第二抗体可结合至pKal。[0139]第一抗体的轻链的Cl可以是本领域中已知的任何Cl。在一些实施方案中，Cl是K轻链。在一些实施方案中，Cl是λ轻链。第一抗体的重链的Ch可以是本领域中已知的任何Ch。在一些实施方案中，Ch是γ重链。这类重链和轻链恒定区在本领域中是熟知的，例如，如本文所述。[0140]在一个实施例中，双特异性抗体在H—L或L—H方向上包括来源于DX-2930的IgG抗体和来源于克隆559C-M0071-F06、559C-M0179-D04、559C-M0181-C02、559C-M0180-G03、559C-M0184-B04、620I-X0173-All、620I-X0173-C07、620I-X0173-E07S620I-X0173-GlU9scFv抗体。见以上公开内容。来源于亲本抗体的抗体可包含与亲本抗体的重链和轻链基本上类似共享至少80%、85%、90%、95%或98%的序列同一性）的重链和轻链。在一些实施例中，这类抗体包含与亲本抗体相同的重链和轻链CDR。在其他实施例中，这类抗体包含与亲本抗体的⑶R基本上一致的重链和或轻链⑶R，例如与亲本抗体的⑶R相比包含多达5、4、3、2或1个氨基酸残基变异，诸如保守的氨基酸残基取代。[0141]在一些实施方案中，双特异性抗体中的scFv抗体包含融合至Vl的N-末端的VH。在其他实施方案中，scFv抗体包含融合至Vl的C-末端的Vh。在本文所述的任何scFv抗体中，Vh区和Vl区可以通过连接体诸如肽连接体融合。[0142]本文所述的肽连接体可包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸残基。在一些实施方案中，肽连接体可包含2-50、5-25或5-20个氨基酸。在一些实施方案中，肽连接体是SGGGS。在一些实施方案中，肽连接体是G4Sx,其中X可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。在一些实施方案中，X是4。[0143]本文所述的任何肽连接体，例如SGGGSSEQIDNO:22连接体或GGGGS4SEQIDN0:23连接体，可包含天然存在的氨基酸和或非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸Ala、精氨酸Arg、天冬酰胺Asn、天门冬氨酸Asp、半胱氨酸Cys、谷氨酸Glu、谷氨酰胺®in、甘氨酸®ly、组氨酸His、异亮氨酸He、亮氨酸Leu、赖氨酸Lys、蛋氨酸Met、鸟氨酸Orn、苯丙氨酸Phe、脯氨酸Pro、丝氨酸（Ser、苏氨酸Thr、色氨酸Trp、酪氨酸Tyr和缬氨酸Val。非天然存在的氨基酸可包括受保护的氨基酸，诸如用基团诸如乙酰基、甲酰基、甲苯磺酰基、硝基等保护的天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸的非限制性实例包括叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、叠氮基苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、包含内烯烃诸如反式巴豆基烯烃）的氨基酸、丝氨酸烯丙基醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、乙烯基甘氨酸、吡咯赖氨酸、Ν-σ-邻-叠氮基苄氧基羰基-L-赖氨酸AzZLys、Ν-σ_炔丙氧基羰基-L-赖氨酸、Ν-σ-2-叠氮基乙氧基羰基-L-赖氨酸、Ν-σ-叔-丁氧基羰基-L-赖氨酸BocLys、Ν-σ-稀丙氧基羰基-L-赖氨酸AlocLys、Ν-σ-乙酰基-L-赖氨酸AcLys、Ν-σ-节氧基羰基-L-赖氨酸ZLys、Ν-σ-环戊氧基羰基-L-赖氨酸CycLys、N-〇-D_脯氨酰基-L-赖氨酸、Ν-σ-烟酰基-L-赖氨酸NicLys、N-〇-N-Me-氨茴酰-L-赖氨酸NmaLys、Ν-σ-生物素基-L-赖氨酸、Ν-σ-9-荷基甲氧基羰基-L-赖氨酸、Ν-σ-甲基-L-赖氨酸、Ν-σ-二甲基-L-赖氨酸、Ν-σ-三甲基-L-赖氨酸、Ν-σ-异丙基-L-赖氨酸、Ν-σ-丹酰-L-赖氨酸、Ν-σ-邻，对-二硝基苯基-L-赖氨酸、Ν-σ-对-甲苯磺酰基-L-赖氨酸、N-o-DL-2-氨基-2羧乙基-L-赖氨酸、Ν-σ-苯基丙酮酰胺-L-赖氨酸、Ν-σ-丙酮酰胺-L-赖氨酸、叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、叠氮基苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、包含内烯烃诸如反式巴豆基烯烃）的氨基酸、丝氨酸烯丙基醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸和乙烯基甘氨酸。[0144]在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体的scFv部分可被工程化，以在Vh链和Vl链两者中引入半胱氨酸残基，用以形成一个或多个二硫键，其可以降低高分子量聚集体的形成。在一些实施例中，半胱氨酸残基可被引入到Vh链的残基44中。可替代地或另外，半胱氨酸残基可被引入到Vl链的残基100中。[0145]示例性抗pKal抗FXIIa双特异性抗体包括在以下实施例中所述的克隆乂0120_A01、X0120-C01、X0120-E01、X0120-G01、X0121-A03、X0121-C01、X0121-E01、X0121-G01、X0122-A01、X0122-C01、620I-X0173-A11、620I-X0173-C07、620I-X0173-E07和620I-X0173-Gll。其它示例性抗pKal抗FXIIa双特异性抗体包括在以下实施例中所述的克隆6201-[0146]双特异性抗体的制备[0147]本领域已知的任何合适的方法，例如标准重组技术，可用于制备本文所述的双特异性抗体。实施例提供如下。[0148]合适的亲本抗体的重链和轻链基因可以通过常规技术例如从合适的来源PCR扩增获得。在一个实施例中，编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA可很容易地被分离，并利用常规程序例如通过利用能够特异性地结合至编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针测序。细胞，诸如杂交瘤细胞，可作为这类DNA的来源。在另一个实施例中，编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA的序列可以例如从数据库或其他公众可用的来源获得，并且DNA可以是合成的。也可以通过用感兴趣的抗原筛选的合适的抗体文库而获得亲本抗体基因。[0149]因此获得的抗体重链和轻链基因可按照常规技术被分析以鉴定互补决定区CDR。本文所述的双特异性抗体中的任何多肽可通过常规重组技术制备，并被插入到合适的表达载体中用于在合适的宿主细胞中生产。[0150]编码本文所述的双特异性抗体的一条或多条多肽的核苷酸序列可被克隆到表达载体中，每条核苷酸序列可操作地与合适的启动子连接。可替代地，核苷酸序列可以可操作地与单启动子连接，以便两条序列从相同的启动子表达。在一些实施例中，两条多肽的表达通过共同的启动子控制。在其他实施例中，两条多肽的每一条的表达在不同启动子的控制下。在另一个可选实施例中，编码两条多肽的核苷酸序列被克隆到两个载体中，所述载体可以被引入到相同细胞中或不同细胞中。当这两条多肽在不同的细胞中表达时，它们中的每一条可从表达它们的宿主细胞分离，并且这两条分离的重链可在适合的条件下混合和孵育，以允许双特异性抗体的形成。[0151]通常，编码双特异性抗体的一条链或所有链的核酸序列可被克隆到利用本领域已知的方法与合适的启动子可操作地连接的合适的表达载体中。例如，核苷酸序列和载体可以在合适的条件下与限制性内切酶接触，以在每个分子上产生互补性端部，所述互补性端部可以彼此配对并且用连接酶连接在一起。可替代地，合成的核酸连接体可以被连接到基因的末端。这些合成的连接体包含对应于载体中特定的限制酶切位点的核酸序列。表达载体启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。[0152]多种启动子可用于本文所述的双特异性抗体的表达，包括但不限于巨细胞病毒CMV中间体早期启动子（intermediateearlypromoter、诸如鲁斯氏肉瘤病毒LTR、HIV_LTR、HTLV-LTR的病毒性LTR、猿猴病毒40SV40早期启动子、大肠杆菌E.colilacUV5启动子和单纯性疱瘆tk病毒启动子。[0153]也可以使用可调节的启动子。这类可调节的启动子包括利用来自大肠杆菌的Iac阻遏物作为转录调节剂以调节携带Iac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录的那些可调节的启动子[8仰¥11，1.等611，49:603-6121987]、利用四环素阻遏物6七1?的那些可调节的启动子[Gossen，M.，和BujarcUH.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-55511992;Yao，F.等，HumanGeneTherapy，9:1939-19501998;Shockelt，P·，等，Proc·Natl.AcacLSci·USA，92:6522-65261995]。其他系统包括FK506二聚体、VP16或p65其利用雌二醇（astradiol、RU486、二酸米乐留酮（diphenolmurislerone或雷帕霉素rapamycin。可诱导的系统可从InvitrogeruClontech和Ariad获得。[0154]可以使用可调节的启动子，包括阻遏物与操纵子。在一个实施方案中，来自于大肠杆菌的Iac阻遏物可作为转录调节剂调节携带Iac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录[M.Brown等，Cell，49:603-6121987];Gossen和Bujard1992;[M.Gossen等，Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-55511992]将四环素阻遏物（tetR与转录激活剂VP16组合以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活剂融合蛋白tTatetR_VP16，其具有来源于人巨细胞病毒hCMV主要即刻早期早期启动子majorimmediate-earlypromoter的携带tetO的最小启动子以产生tetR-tet操纵子系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中，使用四环素可诱导开关。四环素阻遏物tetR单独地，而不是tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物，可作为有效的反式调制剂，以在四环素操纵子正确地布置于CMVIE启动子的TATA元件的下游时调节哺乳动物细胞中的基因表达Yao等，HumanGeneTherapy。该四环素可诱导开关的一个具体的优势是不需要使用四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活剂或阻遏物融合蛋白（其在一些情况下对细胞可能是有毒的）（Gossen等，Natl·Acad.Sci.USA，89:5547-55511992;Shockett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92:6522-65261995来实现其调节效果。[0155]另外，载体可包含例如以下的一些或所有:可选择的标记基因，诸如用于在哺乳动物细胞中选择稳定转染子或瞬时转染子的新霉素基因；来自人CMV的即刻早期基因的增强子启动子序列，用于高水平转录;来自SV40的转录终止信号和RNA加工信号，用于mRNA稳定性;SV40多瘤复制起点和ColEl，用于适当的游离基因复制；内部核糖体结合位点（IRESes，通用型多克隆位点;和T7和SP6启动子，用于有义和反义RNA的体外转录。用于生产包含转基因的合适的载体和方法在本领域是已知的，并且是可以得到的。[0156]对实践本文所述的方法有用的多腺苷酸化信号的实例包括但不限于人胶原I多腺苷酸化信号、人胶原II多腺苷酸化信号和SV40多腺苷酸化信号。[0157]本公开的其他方面涉及用于制备双特异性抗体的方法，包括:在允许第一多肽和第二多肽表达的条件下培养本文所述的宿主细胞或宿主细胞组;和分离包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述的第一多肽的第一核苷酸序列和编码本文所述的第二多肽的第二核苷酸序列。[0158]用于制备本文所述的双特异性抗体的合适的宿主细胞可以是本领域已知可用于蛋白质生产的任何宿主细胞，包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。本文所述的双特异性抗体可以在细菌细胞例如大肠杆菌细胞）中生产。可替代地，双特异性抗体可在真核细胞中生产。在一个实施方案中，抗体在酵母细胞诸如毕赤酵母属Pichia见例如，Powers等，2001，J·Tmmunol.Methods·251:123-35、汉逊氏酵母属Hanseula或酵母属Saccharomyces中表达。在另外一个实施方案中，双特异性抗体可在哺乳动物细胞中生产。用于表达抗体的哺乳动物宿主细胞包括但不限于293细胞见例如ATCCCRL-1573，AmericanTypeCultureCo丨丨ection®美国典型培养物保藏中心）和Expi293F™细胞，LifeTechnologies™美国生命技术公司）、中国仓鼠卵巢CHO细胞）（包括dhfr-CHO细胞，在Urlaub和Chasin，1980，Proc·Natl·Acad·Sci·USA77:4216-4220中描述，与DHFR选择性标记一起使用，例如在Kaufman和Sharp，1982，Mol·Biol·159:601621中所述）、淋巴细胞系例如NSO骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞和来自转基因动物例如转基因哺乳动物的细胞。例如，细胞是乳腺上皮细胞。[0159]在用于本文所述的双特异性抗体的重组表达的示例性系统中，编码双特异性抗体中的两条多肽的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染被引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体中，编码两条多肽的核酸可操作地与增强子启动子调控元件（例如来源于SV40、CMV、腺病毒等，诸如CMV增强子AdMLP启动子调控元件或SV40增强子AdMLP启动子调控元件连接以驱动高水平的基因转录。重组表达载体也携带DHFR基因，其允许已经利用甲氨蝶呤选择扩增被载体转染的CHO细胞的选择。培养选择的转化子宿主细胞以允许两条多肽的表达。因此形成的四聚体分子可以从培养基中回收。另外一个用于重组表达的示例性系统在实施例2中描述。[0160]使用标准的分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。例如，一些抗体可以通过用蛋白质A或蛋白质G耦合基质进行亲和层析而被分离。[0161]双特异性抗体的用途[0162]本文所述的双特异性抗体或编码核酸或核酸组可用于诊断和治疗的目的。它们也可以用作基础研究和治疗研究中的研究工具。[0163]i药物组合物[0164]本文所述的双特异性抗体或编码核酸或核酸组可以与药学上可接受的载体赋形剂），包括缓冲剂，混合，以形成用于治疗目标疾病的药物组合物。“可接受的”意指载体必需与组合物的活性成分相容并且优选地，能够稳定活性成分），并且对待治疗的受试者是无害的。药学上可接受的赋形剂（载体），包括缓冲剂，是本领域所熟知的。见例如Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy第20版（2000LippincottWilliams和Wilkins，Ed·K·E·Hoover〇[0165]待在本发明的方法中使用的药物组合物可包含以冻干制剂形式或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂（Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy第20版（2000LippincottWilliams和Wilkins，Ed.K.E.Hoover。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，其可包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵;苯酚、丁基或苄醇;对羟基苯甲酸烷基酯类诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酸）；低分子量约少于10个残基）多肽;蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖的；螯合剂诸如EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;形成盐的抗衡离子诸如钠;金属复合物例如Zn-蛋白质复合物）；和或非离子表面活性剂诸如TWEEN™、PLUR0NICS™或聚乙二醇PEG〇[0166]在一些实施例中，本文所述的药物组合物包含脂质体，所述脂质体包含双特异性抗体，可以通过本领域已知的方法制备，诸如在Epstein，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:36881985;Hwang，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:40301980;和美国专利号4,485，045和4,544,545中所述。在美国专利号5,013,556中公开了脂质体具有延长的循环时间。特别有用的脂质体可由反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺PEG-PE的脂质组合物产生。脂质体通过具有定义的孔隙尺寸的过滤器挤出，以产生具有预期直径的脂质体。[0167]双特异性抗体或编码核酸也可以被包在例如通过凝聚技术或界面聚合法在胶体药物输送系统例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒子和纳米胶囊或在粗乳状剂中制备的微胶囊中，例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚_甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这类技术在本领域是已知的，见例如Remington，TheScienceandPracticeofPharmacy第20版，MackPublishing2000。在其他实施例中，本文所述的药物组合物可以以缓释形式被配制。缓释制剂的合适的实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，该基质的形式是具有一定形状的制品，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶例如聚（2-羟乙基-甲基丙烯酸酯或聚乙烯醇、聚乳酸美国专利号3,773,919丄-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRONDEPOT™由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球）、蔗糖醋酸异丁酸酯和聚-D-_-3-羟丁酸。[0168]用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这容易通过例如经无菌过滤膜过滤而实现。治疗用抗体组合物通常被放置在具有无菌入口的容器中，例如静脉内溶液袋或具有塞子的小瓶，该塞子可被皮下注射针头穿透。[0169]本文所述的药物组合物可以是单位剂型，诸如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液或悬液、或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或用于通过吸入或吹入施用。为了制备固体组合物诸如片剂，主要活性成分可以与药物载体例如常规的压片成分，诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸氢钙或树胶和其他药物稀释剂例如水混合以形成含有本发明的化和物或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当提到这些预制剂组合物是均匀的时，意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，以便组合物可以容易地被再分成相等的有效单位剂型诸如片剂、丸剂和胶囊剂。然后该固体预制剂组合物被再分成含有从0.1到约500mg的本发明的活性成分的上述类型的单位剂型。新型组合物的片剂或丸剂可被包衣或以其他方式被化合，以提供带来长效优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内剂量组分和外剂量组分，后者的形式为前者上的包膜。这两种组分可以被肠溶层隔开，所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解，从而允许内组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这类肠溶层或包衣，这类材料包括多种聚合酸和聚合酸与这类材料如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。[0170]合适的表面活性剂包括尤其包括）非离子剂诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇（例如Tween™20、40、60、80或85和其他脱水山梨糖醇类（例如3?1^20、40、60、80或85。具有表面活性剂的组合物适宜地包含0.05%至5%之间的表面活性剂，其可以是0.1%至2.5%之间。应该理解，如果必要的话，可以添加其他成分例如甘露醇或其他药学上可接受的载体。[0171]合适的乳剂可以利用商业上可获得的脂肪乳剂（诸如英脱利匹特TMIntralipid™、乐补欣™Liposyn™、Infonutro1™、力保肪宁™Lipofundin™和Lipiphysan™制备。活性成分可以在预先混合的乳剂组合物中溶解，或可替代地，活性成分可在油例如大豆油、红花油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油）和与磷脂例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂混合后形成的乳剂和水中溶解。应该理解，可以添加其他成分例如甘油或葡萄糖，以调节乳剂的张力。合适的乳剂通常包含多达20%的油，例如在5%和20%之间。脂肪乳剂可包含0.1至1.0.im之间的脂肪滴，尤其是0.1至0.5.im之间的脂肪滴，并且具有5.5至8.0的pH范围。[0172]乳剂组合物可以是通过使双特异性抗体和英脱利匹特tmS其组分（大豆油、卵磷月旨、甘油和水混合而制备的那些乳剂组合物。[0173]用于吸入或吹入的药物组合物包括药学上可接受的水或有机溶剂或其混合物中的溶液或悬液。液体或固体组合物可包含上述合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，为了局部或全身作用，组合物通过口腔或鼻呼吸途径施用。[0174]优选的无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可用气体雾化。雾化的溶液可以直接从雾化器中呼吸，或雾化器可以附着在面罩、帐篷tent或间歇式正压呼吸机上。从以适当的方式递送制剂的设备，可优选地经口腔或鼻施用溶液、悬液或粉剂组合物。[0175]ii疾病治疗[0176]本文所述的双特异性抗体或编码核酸或核酸组可用于治疗与双特异性抗体结合的一个或两个抗原相关的疾病或病症。例如，如果双特异性抗体能够结合至PKal和FXIIa并阻断PKal和FXIIa的活性，则其可以用于治疗与接触激活系统的调节异常相关的疾病，例如HAE和血栓形成。[0177]HAE包括I型、II型和III型HAE是特征在于在例如四肢、面部、肠道和气道处严重肿胀反复发作的病症。HAE发作可由轻微创伤或应激触发。由于HAE疾病发作而导致的肠道肿胀可引起严重的腹痛、恶心和呕吐而使。气道内的肿胀可限制呼吸而导致呼吸道威胁生命的阻塞。[0178]血栓形成例如静脉血栓形成或动脉血栓形成是指血管内血凝块的形成，其可阻塞循环系统中血液的流动。血栓形成可包括与心房颤动、DVT、肺栓塞、中风或其他动脉或静脉血栓形成事件相关的血栓形成。[0179]为了实践本文所公开的方法，可将有效量的上述药物组合物通过合适的途径诸如静脉内施用，例如作为丸剂或通过在一段时间内连续输注，经由肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔、吸入或局部途径施用至需要治疗的受试者例如人类）。用于液体制剂的商业上可用的雾化器包括喷气式雾化器和超声雾化器可用于给药。液体制剂可直接被雾化，并且冻干粉末在重构后可以被雾化。可替代地，本文所述的双特异性抗体可利用碳氟化合物制剂和定量雾化吸入器被气雾化或作为冻干粉末和磨碎的粉末被吸入。[0180]经本文所述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人受试者可以是患有目标疾病病症诸如HAE或血栓形成）的、处于患目标疾病病症风险的或被怀疑患有目标疾病病症的人患者。在一些实施方案中，血栓形成与心房颤动、深部静脉血栓形成DVT、肺栓塞、中风或动脉或静脉血栓形成事件相关。患有目标疾病或病症的受试者可以通过常规医学检验例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声而被鉴定。被怀疑患有任何这类疾病病症的受试者可能表现出该疾病病症的一种或多种症状。处于该疾病病症风险的受试者可以是具有该疾病病症的一种或多种风险因素的受试者。[0181]本文所用的“有效量”是指单独或与一种或多种其它活性剂组合时为受试者提供治疗效果所需的每种活性剂的量。如本领域技术人员所认识到的，有效量的变化取决于所治疗的具体病状、病状的严重程度、个体患者参数（包括年龄、身体状况、尺寸、性别和体重）、治疗的持续时间、同步治疗的性质（如果有的话）、具体给药途径以及在健康从业者知识和专业内的类似的因素。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且可仅仅通过常规实验而得到处理。通常优选使用单组分或其组合的最大剂量，即根据合理医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将会理解，由于医疗原因、心理原因或几乎任何其它原因，患者可能坚持使用较低剂量或可耐受剂量。[0182]经验上的考虑，诸如半衰期通常会有助于剂量的确定。例如，可以使用与人免疫系统相容的抗体诸如人源化抗体或完全人抗体来延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主的免疫系统攻击。可以在治疗过程中确定和调整给药频率，其通常但不一定基于目标疾病病症的治疗和或抑制和或改善和或延迟。可替代地，双特异性抗体的持续连续释放制剂可能是合适的。用于实现缓释的各种制剂和装置是本领域已知的。[0183]在一个实施例中，本文所述的双特异性抗体的剂量可以在被给予一次或多次抗体施用的个体中经经验确定。给予个体增量剂量的拮抗剂。为了评估拮抗剂的功效，可以随后施用疾病病症的指示剂。[0184]通常，为了施用本文所述的任何抗体，初始候选剂量可以为约2mgkg。为了本公开的目的，典型的日剂量的范围可以为约〇·lygkg至3ygkg至30ygkg至300ygkg至3mgkg、至30mgkg至100mgkg或更多中的任何一个，这取决于上述因素。对于几天内或更长时间内的重复施用取决于病状），治疗持续到发生所期望的症状抑制或持续到达到足够的治疗水平以减轻目标疾病或病症或其症状为止。示例性的投药方案包括施用约2mgkg的初始剂量，随后每周维持剂量为约lmgkg的抗体，或随后每隔一周维持剂量为约lmgkg。然而，其他剂量方案可能是有用的，这取决于从业者希望实现的药代动力学衰减的模式。例如，考虑每周投药一次至四次。在一些实施方案中，可以使用的投药范围为约3ygmg至约2mgkg诸如约3ygmg、约IOygmg、约30ygmg、约100ygmg、约300ygmg、约lmgkg和约2mgkg。在一些实施方案中，投药频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次;或每月一次、每2个月一次或每3个月一次或更长时间一次。通过常规技术和测定容易地监测该疗法的进展。投药方案包括使用的抗体）可随时间变化。[0185]在一些实施方案中，对于正常体重的成年患者，可施用约0.3至5.00mgkg范围的剂量。具体的剂量方案，即剂量、时间和重复，将取决于具体个体和该个体的病史以及各种药剂的性质诸如药剂的半衰期以及本领域熟知的其它考虑）。[0186]为了本公开的目的，本文所述的双特异性抗体的合适剂量将取决于所使用的特异性抗体或其组合物）、疾病病症的类型和严重程度、抗体是用于预防目的被施用还是用于治疗目的被施用、以前的治疗、患者的临床病史和对拮抗剂的反应以及主治医师的判断。通常，临床医生将施用双特异性抗体，直到达到实现期望结果的剂量。一种或多种双特异性抗体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性还是预防性的以及熟练从业者已知的其它因素。双特异性抗体的施用可以在预选的时间段内基本上连续，或可以是一系列间隔剂量，例如在发展目标疾病或病症之前、期间或之后。[0187]如本文所用，术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用或施用于具有目标疾病或病症、具有该疾病病症的症状或对该疾病病症易感的受试者，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、医治、改善、改良或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的易感。[0188]减轻目标疾病病症包括延缓疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。减轻疾病并不一定需要有疗效的结果。如其中所使用的，“延迟”目标疾病或病症的发展意味着推迟、阻碍、减缓、妨碍、稳定和或延缓疾病进展。这种延迟可以有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和或被治疗的个体。一种“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发病的方法是，与未使用该方法比较时，在给定的时间范围内降低发展一种或多种疾病症状的可能性和或在给定的时间范围内降低症状程度的方法。这种比较通常基于临床研究，其使用足以给出统计学显著结果的多个受试者。[0189]疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和或随后的进展。可以使用本领域熟知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法检测的进展。为了本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发病onset。如本文所用，目标疾病或病症的“发病”或“发生”包括初始发病和或复发。[0190]在一些实施方案中，将本文所述的双特异性抗体以足以在体内抑制一种或两种靶抗原的活性至少20%例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高）的量施用于需要治疗的受试者。在其它实施方案中，抗体以有效降低一种或两种靶抗原的水平至少20%例如，30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高）的量被施用。[0191]根据待治疗的疾病的类型或疾病的部位，可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法向受试者施用药物组合物。该组合物还可以通过其它常规途径施用，例如经口月艮、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、口腔、阴道或经由植入的储库给药。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内，肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。此外，其可以通过可注射的贮库（depot给药途径施用于受试者，诸如使用1-、3_或6月贮库可注射的或可生物降解的材料和方法。[0192]可注射组合物可含有各种载体诸如植物油、二甲基乳酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等）。对于静脉内注射，可以通过滴注法施用水溶性抗体，由此输注含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5%右旋糖、0.9%生理盐水、林格氏溶液或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂例如抗体的合适的可溶性盐形式的无菌制剂可以在药物赋形剂例如注射用水、〇.9%生理盐水或5%葡萄糖溶液中被溶解并施用。[0193]在一个实施方案中，通过位点特异性或靶向局部递送技术施用双特异性抗体。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包括双特异性抗体的各种可植入的贮库源或局部递送导管诸如输注导管、留置导管或针导管）、合成移植物，外膜包裹物，分流器和支架或其它可植入的设备、位点特异性载体、直接注射或直接应用。见例如PCT公开号WO0053211和美国专利号5,981，568。[0194]还可以使用含有反义多核苷酸、表达载体或次基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术在以下中描述：例如Findeis等，TrendsBiotechnol.1993ll:202;Chiou等，GeneTherapeutics:MethodsAndApplicationsOfDirectGeneTransferJ.A.Wolff，编辑）（1994;Wu等，J.Biol.Chem.1988263:621;Wu等，J·Biol·Chem·1994269:542;Zenke等，Proc·NatI·Acad·Sci·USA199087:3655;Wu等，J.Biol.Chem.1991266:338。[0195]含有多核苷酸（例如编码本文所述的双特异性抗体的那些）的治疗组合物在约IOOng至约200mg的DNA范围内被施用，用于在基因治疗方案中局部施用。在一些实施方案中，约500ng至约50mg、约Iyg至约2mg、约5yg至约500yg和约20yg至约IOOyg的DNA浓度范围或更大的浓度范围也可在基因治疗方案中使用。[0196]本文所述的治疗性多核苷酸和多肽可以使用基因递送载体递送。基因递送载体可以是病毒或非病毒来源的（一般见Jolly，CancerGeneTherapy19941:51;Kimura，HumanGeneTherapy19945:845;Connelly，HumanGeneTherapy19951:185;和Kaplitt，NatureGenetics19946:148。可以使用内源性哺乳动物或异源性启动子和或增强子来诱导这类编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型的或调控型的。[0197]用于递送期望的多核苷酸和在期望的细胞中表达的基于病毒的载体是本领域熟知的。基于病毒的载体的实例包括但不限于重组逆转录病毒（见例如PCT公开号WO9007936；W09403622；W09325698；W09325234；W09311230；W09310218；W09102805;美国专利号5,219,740和4,777,127;英国专利号2,200,651;和欧洲专利号0345242、基于甲病毒属的载体例如辛德毕斯病毒Sindbisvirus载体，塞姆利基森林病毒SemlikiforestvirusATCCVR_67;ATCCVR-1247、罗斯河病毒（RossRivervirusATCCVR-373;ATCCVR-1246和委内瑞拉马脑炎病毒ATCCVR-923;ATCCVR-1250;ATCCVR1249;ATCCVR-532和腺伴随病毒AAV载体（见例如PCT公开号WO9412649;W09303769;W09319191;W09428938;W09511984和WO9500655。也可应用Curiel，Hum.GeneTher.19923:147中所述的连接至杀伤的腺病毒的DNA的施用。[0198]也可以使用非病毒递送载体和方法，包括但不限于与杀伤的腺病毒单独连接或未连接的聚阳离子缩合DNA见例如Curiel，Hum.GeneTher.19923:147;配体连接的DNA见例如Wu，J.Biol.Chem.1989264:16985;真核细胞递送载体细胞见例如美国专利号5,814,482;PCT公开号TO9507994;W09617072;W09530763和WO9742338和核电荷中和或与细胞膜融合。也可以使用裸DNA。示例性的裸DNA引入方法在PCT公开号WO9011092和美国专利号5,580,859中描述。可以作为基因递送载体的脂质体在美国专利号5，422,120;PCT公开号WO9513796;W09423697;W09114445和欧洲专利号0524968中描述。另外的方法在Philip，Mol.Cell.Biol.199414:2411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.199491:1581中描述。[0199]在本文描述的方法中使用的特定剂量方案，即剂量、时间和重复，将取决于特定受试者和该受试者的病史。在一些实施方案中，可将多于一种双特异性抗体或双特异性抗体与另一种合适的治疗剂的组合施用于需要治疗的受试者。双特异性抗体也可以与用于增强和或补充药剂的有效性的其它药剂连同使用。[0200]目标疾病病症的治疗效果可以通过本领域熟知的方法进行评估。[0201]用于治疗目标疾病的试剂盒[0202]本公开还提供了用于减轻目标疾病或病症的试剂盒。这类试剂盒可以包括包含本文所述的一种或多种双特异性抗体和或一种或多种分离的核酸或核酸组的一个或多个容器。[0203]在一些实施方案中，试剂盒可以包括根据本文所述的任何方法使用的说明书。所包括的说明书可以包含对双特异性抗体的施用的描述，以治疗、延缓发病或减轻目标疾病诸如HAE或血栓形成。该试剂盒可以进一步包括关于基于鉴定该个体是否患有目标疾病来选择适合于治疗的个体的描述。在其它实施方案中，说明书包括关于向处于目标疾病风险的个体施用抗体的描述。[0204]涉及使用本文所述的双特异性抗体的说明书通常包括关于预期治疗的剂量、投药方案和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、批量包装（例如，多剂量包装）或亚单位剂量。在本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插入物例如，试剂盒中包括的纸张上的书面说明书，但是机器可读说明书例如，磁性或光学存储磁盘上携带的说明书）也是可以接受的。[0205]标签或包装插入物指示组合物用于治疗、延缓发病和或减轻目标疾病或病症。可以提供说明书来实施本文所述的任何方法。[0206]本发明的试剂盒是在合适的包装内。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、软包装例如密封的聚酯薄膜Mylar或塑料袋等。还考虑用于与特定装置组合使用的包装，诸如吸入器、鼻给药装置例如雾化器或诸如微型栗的输注装置。试剂盒可以具有无菌进入口（例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针穿透的塞子的小瓶）。容器还可以具有无菌进入口（例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针穿透的塞子的小瓶）。组合物中至少一种活性剂是如本文所述的双特异性抗体。[0207]试剂盒可以任选地提供额外的组分，诸如缓冲物和解释信息。通常，该试剂盒包括容器和在容器上或与容器连接的标签或包装插入物。在一些实施方案中，本发明提供了包括上述试剂盒的内容物的制品。[0208]常规技术[0209]除非另有说明，本发明的实践将采用在本领域技术范围内的分子生物学包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这些技术在文献中得到充分解释，所述文献诸如MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版Sambrook，等，1989ColdSpringHarborPress;01igonucleotideSynthesisM.J.Gait，编辑，1984;MethodsinMolecularBiology,HumanaPress；CellBiology：ALaboratoryNotebookJ.E.Cellis，编辑，1998AcademicPress;AnimalCellCultureR.I.Freshney，编辑，1987;IntroductiontoCellandTissueCultureJ.P.Mather和P.E.Roberts，1998PlenumPress；CelIandTissueCulturE：LaboratoryProceduresA·Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell，编辑，1993_8J.WileyandSons;MethodsinEnzymologyAcademicPress，Inc·;HandbookofExperimentalImmunologyDWeir和C.C.Blackwell，编辑）；GeneTransferVectorsforMammalianCellsJ.M.Miller和M.P.Calos，编辑，1987;CurrentProtocolsinMolecularBiologyF.M.Ausubel，等，编辑，1987;PCR:ThePolymeraseChainReaction，（Mullis，等，编辑，1994;CurrentProtocolsinImmunologyJ.E.Coligan等，编辑，1991;ShortProtocolsinMolecularBiologyWiley和Sons，1999;ImmunobiologyC.A.Janeway和P.Travers，1997;AntibodiesP·Finch，1997;Antibodies:apracticalapproachD·Catty·，编辑，IRLPress，1988-1989!Monoclonalantibodies：apracticalapproachP·Shepherd和C·Dean，编辑，OxfordUniversityPress，2000;Usingantibodies：alaboratorymanualE·Harlow和D·LaneColdSpringHarborLaboratoryPress，1999;TheAntibodiesM.Zanetti和J.D.Capra，编辑，HarwoodAcademicPublishers，1995〇[0210]在没有进一步的详细阐述的情况下，相信本领域技术人员可以基于上述描述最大限度地利用本发明。因此，以下具体实施方案将被解释为仅仅是说明性的，而不是以任何方式限制本公开的其余部分。本文引用的所有出版物通过引用并入本文，用于本文的目的或用于本文所涉及的主题。[0211]实施例1:结合pKal和因子XIIa的示例性双特异性抗体的构建和表征[0212]使用DX-2930和抗FXIIa克隆559C-M0071-F06、559C-M0184-B04、559C-M0179-D04、559C-M0181-C02和559C-M0180-G03中的一个作为亲本抗体，构建了一些示例性抗pKal抗FXIIa双特异性抗体，包括克隆XO120-A01、XO120-C01、XO120-E01、XO120-G01、XO121-A03、X0121-C01、X0121-E01、X0121-G01、X0122-A01和X0122-C01。见下表2:[0213]表2:示例性双特异性抗体的组分[0214][0215]在抗FXIIa克隆中，559C-M0071-F06是亲本克隆，559C-M0184-B04从HCDR1+2亲和力成熟中获得，且559C-M0179-D04、559C-M0181-C02和559C-M0180-G03是从轻链亲和力成熟中获得的克隆。[0216]上述表2中列出的所有示例性双特异性抗体克隆是四价分子，其包含四条多肽链，包括DX-2930的轻链的两条多肽链上文提供的SEQIDNO:10，和与FXIIa克隆之一的scFv链融合的DX-2930的重链的两条融合多肽链（不包括恒定链的铰链结构域中的赖氨酸残基）。5种抗FXIIa克隆中的每一个的scFv链均以重-轻H—L方向和轻-重L—H方向合成。在scFv链的所有实施例中，使用内部GGGGS4连接体SEQIDNO:23。构建scFv，以便轻-重方向的克隆含有初始的两个氨基酸（RT，所述氨基酸在连接体序列开始之前开始initiate恒定区。重-轻方向的克隆在终止密码子之前仅含有来自轻链恒定区的第一个氨基酸⑻。[0217]示例性双特异性抗体的每一个的融合多肽的氨基酸序列提供如下：[0218]双特异性抗体克隆X0120-A01重链-ScFv融合物SEQIDN0:11:[0220]双特异性抗体克隆X0120-C01重链-ScFv融合物SEQIDN0:12:[0223]双特异性抗体克隆X0120-E01重链-ScFv融合物SEQIDN0:13:[0225]双特异性抗体克隆X0120-G01重链-ScFv融合物SEQIDN0:14:[0227]双特异性抗体克隆X0121-A03重链-ScFv融合物SEQIDN0:15:[0230]双特异性抗体克隆X0121-C01重链-ScFv融合物SEQIDN0:16:[0232]双特异性抗体克隆X0121-E01重链-ScFv融合物SEQIDN0:17:[0234]双特异性抗体克隆X0121-G01重链-ScFv融合物SEQIDN0:18:[0237]双特异性抗体克隆X0122-A01重链-ScFv融合物SEQIDN0:19:[0239]双特异性抗体克隆X0122-C01重链-ScFv融合物SEQIDN0:20:[0241]为了构建上述示例性双特异性抗体的表达盒，将DX-2930的重链和轻链的编码序列克隆到PRhl-CHO载体中，用与scFv编码序列连接的C-末端SGGGS连接体修饰。连接区含有用于有效克隆scFv的BamHI限制性酶切位点。选择5个抗因子XIIa克隆，通过BamHIXbal限制性酶切位点插入构建体中。[0242]上文提供的序列的斜体部分是指信号肽。本文公开的双特异性抗体的抗pKal部分可以包含相同的信号肽，或者可以被去除信号肽或用不同的信号肽替换信号肽。用于产生分泌蛋白的信号肽是本领域熟知的。[0243]编码双特异性抗体的核苷酸序列（以顺-反操纵子形式提供如下：[0244]X0120-A01SEQIDNO：24[0264]产生编码上述双特异性抗体的pRhl表达质粒。经0.2um无菌过滤后，将质粒转染到Expi293F™细胞的60mLdl培养物中，使用ExpiFectamine™作为转染试剂在Expi293™表达培养基中培养，如LifeTech方案LifeTechnologies™，加利福尼亚卡尔斯巴德所述。在LifeTech方案中描述的培养的第2天加入Expifectamine™转染增强剂1和2。培养物在37°C、8%CO2、HOrpm孵育7天。通过离心收获培养物，然后进行0.2um无菌过滤，并在4°C储存。使用蛋白A柱分批纯化克隆。[0265]将不同浓度的双特异性抗体与单独的FXIIa和pKal样品一起孵育，并且通过测量共价连接到肽底物的化学部分的荧光的变化来随着时间监测这些蛋白酶裂解肽底物的能力。该动力学数据的斜率等于酶促蛋白水解速率，然后针对抑制剂的浓度将其作图。然后通过非线性回归将所得到的图拟合到紧密结合抑制剂方程（tightbindinginhibitorequation方程式1以获得表观抑制常数K1aptO。[0267]图1和图2显示了测试的每种双特异性抗体的pKa1和FXIIa抑制活性的图。所有测试的克隆都能够抑制PKal和FXIIa二者。每种双特异性抗体的KiappPKal和FXIIa列在下面表3中。[0268]表3.双特异性抗体的表观抑制常数[0271]实施例2:结合pKal和因子XIIa的示例性双特异性抗体的构建和表征[0272]如下构建了另外一组示例性抗pKal抗FXIIa双特异性抗体。分子的IG部分与实施例1中所用的相同，即DX-2930。对于抗FXIIa组分，选择36个分离株，并将其转变为轻链重链和重链轻链方向的scFv。使用SGGGSSEQIDN0:22连接体将scFv融合到DX-2930IgG。当构建scFv时，使用G4S4连接体将抗FXIIa可变重链和可变轻链结构域彼此融合。以下提供双特异性抗体的序列。[0273]构建的双特异性分子显示出与先前对于DX-2930测定的值大体一致的抗pKal活性表4。一些值显示针对pKal较弱的效力，可能是由于计算浓度的错误，或可能由于聚集。scFv组分的抗FXIIa活性通常低于先前测定的值，这可能是由于与scFv相关的固有不稳定性表4。血浆测定中双特异性分子的活性显示了超过DX-2930和抗FXIIaIgG的显著改善。该测定中DX-2930显示的范围在70-100nM之间，而抗FXIIa亲本抗体显示在^lOOnM范围的抑制。测试的双特异性分子的图显示在I-IOnM范围内的抑制表5。[0274]表4.针对各自的靶标的72种双特异性抗pKal+抗FXIIa抗体的表观灯。0乂_2930和FXIIa主要候选物（559C-M0292-D07被用作对照。[0282]表5:血浆激活测定中亲本抗FXIIa分离株和抗pKal抗FXIIa双特异性分子的比较。血浆稀释1:40。向稀释的血浆中加入抑制剂。将2.5%鞣花酸加入血浆中。2分钟后，通过加入玉米胰蛋白酶抑制剂猝灭激活。通过添加前焚光profluorescent底物测量pKal活性。[0285]选择5种示例性候选物^20I-X0136-D12、620I-X0136-C05、620I-X0136-C11、620I-X0136-G05和620I-X0136-A01，作进一步分析。在这5种主要候选物（中，620I-X0136-AOl由于低表达值和尺寸排阻色谱SEC踪迹中的多种类而被淘汰。在剩余的4个主要候选物（中，每个分离株含有不同程度的高分子量聚集体16-35%图3。该聚集体被确定为浓度依赖性的，并且假定其是通过scFv结构域相互作用的二聚体结构。[0286]通过血浆抑制测定评估示例性双特异性抗体620I-X0136-D12D12抑制血浆pKal活性的能力。简言之，在存在或不存在HMWK的情况下，在测定缓冲液（20mMTris-HClpH7·5、150mMNaCl、lmMEDTA、0·l%PEG-8000和0·l%TritonX-100中，将含有大量的前pKal和FXII的重构血浆以1:40稀释。前-pKal、FXII和HMWK的浓度等于其在血浆中的正常浓度。在室温，在96孔微孔板中将不同浓度的抑制剂加入到重构血浆中。然后通过加入25%2.5%最终稀释的鞣花酸溶液引发接触激活，通过轻轻摇动混合微孔板，并在室温进行2分钟，借以加入IOOnM的CTI。然后将10μ1该混合物移至重复微孔板中，所述微孔板含有在30°：预平衡的80μ1测定缓冲液。然后将该稀释板在30°C再孵育5分钟，并如上评估PFR-AMC的蛋白水解，但用X轴中使用的反算的back-calculated抑制剂浓度进行曲线拟合至针对紧密结合抑制剂的修饰的莫里森Morrison方程在最终测定读数中，血楽被稀释1:400。本研究的结果显示在图5在存在单链HMWK的情况下和图6在不存在HMWK的情况下）中。双特异性抗体表现优于亲本IgG的总和，特别是在存在HMWK的情况下。使用紧密结合抑制剂方程，在HMWK存在下，D12的表观Ki值测定为8.8nM，在不存在HMWK的情况下测定为2.6nM。[0287]还评估了与抗FXIIa抗体（D06和抗pKal抗体（H03相比，双特异性抗体候选物620I-X0136-D12D12在APTT测定中延迟活化部分凝血活酶时间APTT的能力（图7。简言之，以三种浓度25、50、100将抑制剂分子或对照稀释缓冲液=25mMHEPE、pH7.5、125mMNaCl以1:1混合加入到纯血浆neatplasma中，并在37°C预平衡5分钟。将2X50μ1该混合物分配到2个单独的KC4A测定样品池cuvette带金属球）中。60秒后，将50μ1aPTT试剂激活剂，PacificUntasisAPTT-XL加入到旋转的样品池中，并在加入aPTT在t=0秒后180秒加入50μ1的CaCdCAΔ仪器以秒为单位记录凝结时间。[0288]还评估了双特异性抗体候选物620I-X0136-D12D12抑制纤维蛋白形成的能力图8〇[0289]抗体序列：本实施例中描述的所有双特异性分子均含有第一多肽，所述第一多肽链在重链轻链或轻链重链方向上包含DX-2930重链、SGGGS连接体和抗FXIIascFvJX-2930轻链也使用相同的载体表达。对于每个分离株只列出重链+scFv序列。[0290]DX_2930轻链没有信号序列）[0292]来源于36种示例性抗FXIIaIgG的双特异性：[0293]620I-X0136-C07=DX2930重链+559C-M0177-B11L4HscFv包含具有二硫化物的scFv的双特异性抗体的SEC分析显示出高分子量峰的显著降低，使范围降至1-2%。图4。这种聚集的降低适用所有测试浓度。这些双特异性克隆的Biacore显示出与pKal和FXIIa的紧密、特异性的结合（图9。这些分离株的血浆抑制范围为0.5至8nM范围（图10。[0439]进行如本文所述的血浆抑制测定以测定双特异性抗体6201-XO177-A01的抑制活性。将血浆稀释1:40,并将抑制剂加入到稀释的血浆中。将2.5%最终浓度）的稀释鞣花酸溶液加入到血浆中。大约2分钟后，通过加入CTI猝灭血浆激活。通过加入本文所述的前荧光底物来测量血浆中的PKal活性。由此获得的结果显示于图11中。[0440]将克隆620I-X0177-A01的抑制活性与单独的或组合的亲本抗体的抑制活性进行比较。在亲本IgG和双特异性抗体之间观察到亲和力的急下降。图12。[0441]此外，根据本文所述的方法评估各种双特异性抗体对APTT的能力。所有测试的抗体显示APTT的剂量依赖性延迟。图13。[0442]还检验了抗体克隆IAOl抗FXIIa和7A01针对pKal和FXII两者的双特异性抑制纤维蛋白沉积的能力，结果显示于图14中。观察到纤维蛋白沉积的剂量依赖性抑制。[0443]总体而言，酶抑制测定确定了示例性双特异性抗体6201-XO177-AO1的单独的抗pKal和抗FXIIa组分的表观Ki值与亲本分子相似，表观Ki值分别为389pM和73pM。令人惊讶的是，在接触-激活的稀释血浆方面的另外的实验显示，该双特异性抗体在预防PKal产生方面的效力是亲本抗体的1:1组合的5倍，并且是任一种单独的亲本抗体的效力的20倍。这些数据表明双特异性抗体在其关闭（shutdown接触系统激活的正反馈环的能力方面有独特的效力。[0444]下文提供了具有二硫化物限制的scFv的双特异性抗体的序列：[0445]620I-X0173-A11620I-X0177-A01=620I-X0136-D12种系化的+基因优化的scFv+二硫化物稳定化[0447]620I-X0173-C07620I-X0177-C01=620I-X0136-C05种系化的+基因优化的scFv+二硫化物稳定化[0449]620I-X0173-E07620I-X0177-E01=620I-X0136-C11种系化的+基因优化的scFv+二硫化物稳定化[0451]620I-X0173-G11620I-X0177-G01=620I-X0136-G05种系化的+基因优化的scFv+二硫化物稳定化[0453]实施例4:具有C-末端突变和或缺失的示例性双特异性抗体的构建和表征[0454]评估示例性双特异性抗体（620I-X0177-A01、620I-X0177-C01、620I-X0177-E01、620I-X0177-G01的生产性和可制造性。在分析前，将双特异性抗体的样品在室温，在各种pH下孵育48小时。然后将样品在SDS-PAGE蛋白凝胶上分离，如例如针对图15中的双特异性抗体620I-X0177-A01所示的，或通过尺寸排阻色谱分析（图16A-16C。在还原条件下观察到30kDa和50kDa条带的pH依赖性增加和80kDa条带的降低（图15,泳道2-6。这些意想不到的条带的出现appearance表明双特异性抗体正在经历未预料到的蛋白水解裂解。在非还原条件下，相同的30kDa种类的出现表明裂解的种类是单体的（图15,泳道6-8。通过SEC分析，在代表正确形成的双特异性抗体的15.7-16.1分钟，在代表DX-2930的17分钟，在代表裂解的单链抗体的22分钟观察到峰图16。[0455]设计示例性双特异性抗体以去除IgGl重链C末端赖氨酸残基或将赖氨酸突变为甘氨酸残基。[0456]以下提供双特异性抗体的第一多肽的氨基酸序列，所述第一多肽的第一抗体的重链的C-末端赖氨酸残基缺失或C-末端赖氨酸突变为甘氨酸残基。这些第一多肽可以与DX-2930的轻链配对。[0457]620I-X0179-A09IgG-C-末端赖氨酸缺失的620I-X0177-A01[0459]620I-X0179-C01IgG-C-末端赖氨酸突变为甘氨酸的620I-X0177-A01[0461]620I-X0179-E05IgG-C-末端赖氨酸缺失的620I-X0177-C01[0463]620I-X0179-G05IgG-C-末端赖氨酸突变为甘氨酸的620I-X0177-C01[0464][0465]620I-X0180-A05IgG-C-末端赖氨酸缺失的620I-X0177-G01[0466][0467]620I-X0180-C11IgG-C-末端赖氨酸突变为甘氨酸的620I-X0177-G01[0468][0469]620I-X0180-E07IgG-C-末端赖氨酸缺失的620I-X0177-E01[0471]620I-X0180-G03IgG-C-末端赖氨酸突变为甘氨酸的6201-X0177-E01[0473]在t=0时，通过在SDS-PAGE凝胶上分离双特异性抗体来评估每个示例性双特异性抗体，其第一抗体重链的C-末端赖氨酸残基缺失或C-末端赖氨酸突变为甘氨酸残基（图17。每个示例性双特异性抗体的样品也使用AmiconIOkDa分子量截留旋转过滤器在50mMHepes，pH7.5中浓缩至约10mgmL，并在室温孵育48小时。然后通过SDS-PAGE凝胶评估样品图18。在每种情况下，C-末端赖氨酸的缺失或突变降低或消除了来自双特异性抗体的scFv的裂解。[0474]双特异性的样品也通过分析尺寸排阻色谱进行评估，证明C-末端赖氨酸的缺失或突变降低了双特异性抗体的裂解（图19-20。还通过将抗体与EndoLysC在37°C孵育1小时，然后在SDS-PAGE凝胶上分离，来评估双特异性抗体的裂解（图21。50kDa的蛋白条带对应于DX-2930的Fab部分，和IOOkDa的条带对应于Fc-scFv的同源二聚体，进一步表明重链C-末端赖氨酸的缺失或突变降低了双特异性抗体的裂解。[0475]与DX-2930和DX-4012对照相比，C-末端赖氨酸缺失或突变的示例性双特异性抗体的特征还在于能够抑制pKal、FXIIa和活化血浆表1，图22-24。发现每个示例性双特异性抗体在功能上等同于亲本双特异性抗体该双特异性抗体不包含IgGl重链C-末端赖氨酸的缺失或突变）。突变可能降低双特异性抗体的电荷异质性。[0476]表6:用于生物化学测定的双特异性抗体以及DX-2930和DX-4012对照IgG的总结。进行测定以测量对PKa1的抑制、对FXIIa的抑制和对活化血浆的抑制。[0479]可替代地或另外，在上述的抗FXIIascFv的C-末端的Lys-ArgKR基序可被去除。以下提供了示例性双特异性抗体多肽的氨基酸序列，所述多肽的第一抗体的重链的C-末端赖氨酸残基缺失或C-末端赖氨酸突变为甘氨酸残基并且scFv的C-末端赖氨酸-精氨酸残基缺失。[0480]620I-X0186-C05IgG-C-末端赖氨酸缺失和C-末端KR被去除的620I-X0177-A01[0482]620I-X0185-C01IgG-C-末端赖氨酸突变为甘氨酸和C-末端KR被去除的6201-X0177-A01[0484]620I-X0186-E05IgG-C-末端赖氨酸缺失和C-末端KR被去除的620I-X0177-C01[0486]620I-X0185-E01IgG-C-末端赖氨酸突变为甘氨酸和C-末端KR被去除的6201-X0177-C01[0487][0488]620I-X0186-A05IgG-C-末端赖氨酸缺失和C-末端KR被去除的620I-X0177-G01[0489][0490]620I-X0185-A03IgG-C-末端赖氨酸突变为甘氨酸和C-末端KR被去除的6201-X0177-G01[0491][0492]620I-X0186-G07IgG-C-末端赖氨酸缺失和C-末端KR被去除的620I-X0177-E01[0493][0494]620I-X0185-G01IgG-C-末端赖氨酸突变为甘氨酸和C-末端KR被去除的6201-X0177-E01[0495][0496]上面列出的多肽可以与DX-2930的轻链配对形成双特异性抗体，其也在本公开的范围之内。[0497]其他的实施方案[0498]本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同，等同或相似目的的可替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是等同或类似特征的通用系列的实例。[0499]通过上面的描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施方案也在权利要求书的范围内。

权利要求：1.一种双特异性抗体，其包含：第一多肽，其包含第一抗体的轻链，所述轻链包含轻链可变区（I和轻链恒定区（α;和第二多肽，其包含第一抗体的重链，所述重链包含重链可变区Vh和重链恒定区（Ch，其中所述第一多肽或所述第二多肽进一步包含第二抗体，所述第二抗体是单链抗体，并且融合至所述第一多肽或所述第二多肽的C-末端;和其中所述第一抗体和所述第二抗体中的一个结合血浆激肽释放酶PKal，并且另一个抗体结合因子XII。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体融合至所述第二多肽的C-末端。3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体结合pKal和所述第二抗体结合因子XII。4.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体中的一个结合活性血浆激肽释放酶PKal和或另一个抗体结合活性因子XIIFXIIa。5.根据权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体是IgG。6.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其中所述IgG包含突变的重链，所述突变的重链与野生型对应物相比C-末端赖氨酸残基被缺失或突变。7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的所述重链包含C-末端甘氨酸残基，而不是赖氨酸残基。8.根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体在其C-末端不包含KR基序。9.根据权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是四价的。10.根据权利要求2-9中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二多肽包含在所述第一抗体的所述重链和所述第二抗体之间的肽连接体。11.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述肽连接体是SGGGS。12.根据权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体，其中所述α是κ轻链。13.根据权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体，其中所述α是λ轻链。14.根据权利要求1-13中任一项所述的双特异性抗体，其中在所述第二抗体中，所述Vh融合至所述Vl的N-末端。15.根据权利要求1-13中任一项所述的双特异性抗体，其中在所述第二抗体中，所述Vh融合至所述Vl的C-末端。16.根据权利要求11或15所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体包含在所述Vh区和所述Vl区之间的肽连接体。17.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述肽连接体是G4S4t318.根据权利要求1-17中任一项所述的双特异性抗体，其中在所述第二抗体中的所述Vh链和所述I链之间形成二硫键。19.根据权利要求18所述的双特异性抗体，其中所述二硫键在Vh链中的C44和I链中的Cioo之间形成。20.根据权利要求1-19中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的所述Vh具有与SEQIDNO:1中的互补决定区（CDR相同的互补决定区（CDR。21.根据权利要求20所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的Vh包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。22.根据权利要求1-21中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的所述重链包含SEQIDNO:9的残基20-470的氨基酸序列。23.根据权利要求22所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的所述重链包含SEQIDNO:9、149或150的氨基酸序列。24.根据权利要求1-23中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的所述I具有与SEQIDNO:2中的CDR相同的CDR。25.根据权利要求24所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的所述Vl包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。26.根据权利要求1-24中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体的所述Vh具有与SEQIDN0:3、4和123-126中任一个的CDR相同的CDR。27.根据权利要求26所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体的所述Vh包含SEQIDNO:3、4和123-126的氨基酸序列中的任一种。28.根据权利要求1-27中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体的所述I具有与SEQIDNO:5-8和127中的任一个的CDR相同的CDR。29.根据权利要求28所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体的所述Vl包含SEQIDNO:5-8和127的氨基酸序列中任一个的残基1-111。30.根据权利要求29所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体的所述Vl包含SEQIDNO:5-8和127的氨基酸序列中的任一种。31.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸序列和所述第二多肽包含选自由SEQIDN0:ll-20、47-122、141-148和151-158组成的组的氨基酸序列。32.根据权利要求31所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸序列和所述第二多肽包含选自由SEQIDN0:47-50组成的组的氨基酸序列。33.根据权利要求31所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸序列和所述第二多肽包含选自由SEQIDNO:141-148和151-158组成的组的氨基酸序列。34.—种双特异性抗体，其包含结合至血浆激肽释放酶pKal的第一抗体和结合至因子XIIa的第二抗体。35.根据权利要求34所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体包含Vh链和或I链，所述Vh链包含与SEQIDNO:1中的互补决定区（CDR相同的互补决定区（CDR，所述Vl链包含与SEQIDNO:2中的CDR相同的CDR。36.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的所述Vh包含SEQIDNO:1的氨基酸序列，和或所述第一抗体的所述Vl包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。37.根据权利要求34-36中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体包含Vh链和或Vl链，所述Vh链包含与SEQIDNO:3、4和123-126中任一个的CDR相同的CDR，所述Vl链包含与SEQIDNO:5-8和127中任一个的CDR相同的CDR。38.根据权利要求37所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体的所述VH链包含SEQIDNO:3、4和123-126的氨基酸序列中的任一种；和或所述第二抗体的所述VL包含SEQIDNO:5-8和127的氨基酸序列中的任一个的残基1-111。39.分离的核酸或核酸组，其包含编码权利要求1-38中任一项所述的第一多肽的第一核苷酸序列和编码权利要求1-38中任一项所述的第二多肽的第二核苷酸序列。40.根据权利要求39所述的核酸或核酸组，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列位于两个分开的核酸分子上。41.根据权利要求39所述的核酸或核酸组，其中所述第一核酸核苷酸序列和所述第二核酸核苷酸序列位于一个核酸分子上。42.根据权利要求40所述的核酸或核酸组，其为包含第一载体和第二载体的载体组，所述第一载体包含第一核苷酸序列，所述第二载体包含第二核苷酸序列。43.根据权利要求42所述的核酸或核酸组，其中所述第一载体和所述第二载体是表达载体，在所述表达载体中，所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列各自可操作地与启动子连接。44.根据权利要求41所述的核酸或核酸组，其为包含所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者的载体。45.根据权利要求44所述的核酸或核酸组，其中所述载体是表达载体，在所述表达载体中，所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列可操作地与共同的启动子或不同的启动子连接。46.—种药物组合物，其包含⑴权利要求1-38中任一项所述的双特异性抗体或权利要求39-45中任一项所述的核酸或核酸组，和ii药学上可接受的载体。47.—种用于治疗与接触激活系统相关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求46所述的药物组合物。48.根据权利要求47所述的方法，其中与接触激活系统相关的所述疾病是遗传性血管性水肿或血栓形成。49.宿主细胞或宿主细胞组，其包含权利要求39-45中任一项所述的载体或载体组。50.用于制备双特异性抗体的方法，所述方法包括：在允许第一多肽和第二多肽表达的条件下培养权利要求49所述的宿主细胞或宿主细胞组;和分离包含所述第一多肽和所述第二多肽的所述双特异性抗体。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码所述第一多肽的第一核苷酸序列和编码所述第二多肽的第二核苷酸序列。52.用于治疗与接触激活系统相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含（i权利要求1-38中任一项所述的双特异性抗体或权利要求39-45中任一项所述的核酸或核酸组，和ii药学上可接受的载体。53.根据权利要求52所述的用于使用的药物组合物，其中与接触激活系统相关的所述疾病是遗传性血管性水肿或血栓形成。54.权利要求1-38中任一项所述的双特异性抗体或权利要求39-45中任一项所述的核酸或核酸组在制备用于治疗与接触激活系统相关的疾病的药物中的用途，其中任选地所述疾病是遗传性血管性水肿或血栓形成。

百度查询： 武田药品工业株式会社 针对血浆激肽释放酶和因子XII的双特异性抗体