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申请/专利权人：四川大学

摘要：本发明涉及JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途，属于医药领域。本发明提供了JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途。动物实验表明，JMJD3特异性抑制剂GSK‑J4能够明显改善胰腺炎模型小鼠腺泡细胞坏死、水肿和炎性细胞浸润等病理病变，降低胰腺和肺组织中浸润的单核细胞和中性粒细胞的比例，降低胰腺、肺和外周血中TNF‑α阳性单核细胞的百分比，对胰腺炎发挥显著的治疗作用。本发明为胰腺炎的治疗提供了新的生物治疗靶点，通过对人类临床胰腺组织和血液标本相关指标的检测，进一步证明将JMJD3特异性抑制剂GSK‑J4用于胰腺炎患者的治疗具有可行性。

主权项：1.JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途；所述的药物抑制由mtDNA和或氧化mtDNA诱导的JMJD3表达上调；所述的胰腺炎为急性胰腺炎；所述的JMJD3抑制剂为JMJD3特异性抑制剂；所述的JMJD3抑制剂是式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：

全文数据：JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途技术领域本发明涉及JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途，属于医药领域。背景技术表观遗传学是一门研究基因核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达可遗传变化的学科。与传统遗传学一样，表观遗传学通过调节生物体内基因转录的过程，进而影响人类生命生长发育有关的基础生理学功能。常见的表观遗传修饰机制主要包括：DNA修饰、组蛋白修饰、RNA修饰、染色质重塑和非编码RNA等。其中，组蛋白修饰是目前研究最为广泛的表观遗传修饰机制，根据组蛋白修饰调控因子的不同，可将这些调控因子分为三个大类：写入因子、擦除因子、识别因子。组蛋白去甲基化酶是一类重要的擦除因子，主要参与调控生物体内组蛋白甲基化平衡。有关研究报道了靶向于表观遗传修饰酶的药物在炎症、恶性肿瘤、发育性疾病和衰老相关疾病过程的调控中表现出良好前景，提示对于部分难治型疾病，表观遗传学的介入不失为新的切入点。JMJD3作为一种重要的表观遗传修饰酶，能特异性地去除目的基因启动子H3K27的甲基化，激活基因的转录，因而在器官及组织发育、细胞分化和衰老、维持机体免疫功能等方面具有重要作用。然而，目前对于JMJD3的临床研究还较少，已有的报道主要集中在肿瘤的发生及免疫系统疾病。例如，骆俊民通过对45例结肠癌患者的癌组织研究发现，结肠癌中JMJD3低表达可能与肿瘤的恶性程度有关参见：骆俊民.JMJD3在结肠癌中的表达及临床意义研究.临床医药文献电子杂志,2016,339:7785-7786.。胡贺芳等检测53例肺癌患者的癌组织中JMJD3的表达情况发现，JMJD3表达降低可能促进了肺癌的发生参见：胡贺芳,时辉,车国卫,等.肺癌组织中含十字形结构域蛋白3表达的意义.中国呼吸与危重监护杂志,2011,102:168-170.。李彦伟等在对50例胶质瘤患者的研究中也发现，与瘤旁脑组织相比，胶质瘤中JMJD3的表达降低参见：李彦伟,王哲.胶质瘤细胞组蛋白去甲基化酶JMJD3表达降低.细胞与分子免疫学杂志,2014,305:525-526,529.。迄今，尚未见将JMJD3作为治疗胰腺炎靶点的相关报道。发明内容本发明的目的在于提供JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途。本发明提供了JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途。进一步地，所述的药物是防治胰腺炎并发肺损伤的药物。进一步地，所述的胰腺炎为急性胰腺炎。进一步地，所述的胰腺炎由化学品导致。进一步地，所述的胰腺炎由左旋精氨酸和或雨蛙素导致。进一步地，所述的药物抑制由mtDNA和或氧化mtDNA诱导的JMJD3表达上调。进一步地，所述的JMJD3抑制剂为JMJD3特异性抑制剂。进一步地，所述的JMJD3抑制剂是式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：进一步地，所述的药物是以JMJD3抑制剂为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。进一步地，所述的制剂为口服制剂或注射制剂。本发明提供了JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途。动物实验表明，JMJD3特异性抑制剂GSK-J4能够明显改善胰腺炎模型小鼠腺泡细胞坏死、水肿和炎性细胞浸润等病理病变，降低胰腺和肺组织中浸润的单核细胞和中性粒细胞的比例，降低胰腺、肺和外周血中TNF-α阳性单核细胞的百分比，对胰腺炎发挥显著的治疗作用。本发明为胰腺炎的治疗提供了新的生物治疗靶点，通过对人类临床胰腺组织和血液标本相关指标的检测，进一步证明将JMJD3特异性抑制剂GSK-J4用于胰腺炎患者的治疗具有可行性。附图说明图1为实施例1中急性胰腺炎小鼠和胰腺炎患者胰腺组织及胰腺单核细胞中JMJD3表达水平检测结果图；图2为实施例2中急性胰腺炎小鼠和胰腺炎患者体内氧化mtDNA水平及JMJD3表达增加机制检测结果图；图3为实施例3中采用GSK-J4治疗左旋精氨酸和雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎实验结果图。具体实施方式本发明提供了JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途，这是基于发明人的下列发现而完成的：通过检测急性胰腺炎小鼠和胰腺炎患者体内JMJD3的表达，本发明发现了JMJD3在急性胰腺炎早期表达上调，且急性胰腺炎小鼠和胰腺炎患者血清mtDNA和氧化mtDNA可诱导JMJD3表达。基于此，本发明进行了动物实验：采用雨蛙素和左旋精氨酸诱导的C57BL6小鼠急性胰腺炎模型，HE染色法检测JMJD3特异性抑制剂GSK-J4对急性胰腺炎小鼠胰腺和肺组织病理损伤程度的影响；流式细胞术检测GSK-J4对急性胰腺炎小鼠胰腺、肺中单核细胞和中性粒细胞浸润水平及胰腺、肺和外周血中TNF-α阳性单核细胞水平的影响。实验结果证明，GSK-J4能显著降低雨蛙素和精氨酸诱导的急性胰腺炎小鼠炎症，并有效抑制单核细胞炎性细胞因子TNF-α产生，说明JMJD3是治疗胰腺炎的有效靶点。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。以下实验中使用的GSK-J4是式Ⅰ所示的化合物：以下实验中涉及到主要实验手段的操作方法如下：1.免疫荧光染色1组织免疫荧光染色：取新鲜或液氮冻存胰腺组织块于金属组织托上用OCT胶包埋，-80℃保存2小时待OCT胶凝固变硬后制作胰腺组织冰冻切片。将制作好的冰冻切片浸入预冷丙酮内固定20min。将固定好的切片浸没于漂洗缸内PBS缓冲液里，摇床摇动漂洗2次，每次5min。组织薄片上滴加山羊血浆，于37℃封闭2小时，PBS缓冲液漂洗2次，每次5min；细胞免疫荧光染色：将小鼠骨髓单核细胞铺入放有细胞爬片的六孔板中，细胞贴壁并刺激后，使用新鲜配制的2％多聚甲醛固定细胞10min。PBS缓冲液轻轻洗2次，每次5min。滴加山羊血浆于37℃封闭2小时，PBS缓冲液轻轻漂洗2次，每次5min。2滴加细胞膜marker一抗20-50μlAPC-大鼠抗小鼠CD45抗体，Biolegend，Cat#147708，1:100；PerCP-Cy5.5大鼠抗小鼠CD11b抗体，Biolegend，Cat#101228，1：100，PE-大鼠抗小鼠Ly6G抗体，Biolegend，Cat#127608，1：100；FITC-大鼠抗小鼠Ly6C抗体；Biolegend，Cat#128005，1：100；APC-小鼠抗人HLA-DR抗体，Biolegend，Cat#307610，1：100；PerCP-Cy5.5小鼠抗人CD16抗体，Biolegend，Cat#302028，1：100；PE-小鼠抗人CD14抗体，Biolegend，Cat#367104，1：100，保鲜膜封闭暗盒，防止挥发，4℃过夜。37℃复温2小时，PBS缓冲液漂洗两次，每次5min，洗去多余一抗。1％TritonX-100打孔，PBS缓冲液漂洗两次，每次5min。滴加核蛋白一抗20-50μl,保鲜膜封闭暗盒，防止挥发，4℃过夜。滴加细胞膜marker和核蛋白对应二抗兔抗小鼠-JMJD3一抗，1：400，Cat#GTX31466，GeneTex；大鼠抗小鼠Ly6C一抗，1：400，ab24973，Abcam；CY3-共轭山羊抗兔二抗，1：200，ab6939，Abcam；Alexa488山羊抗大鼠二抗，1：200，ab150081，Abcam；山羊抗8-OHdG一抗；1：200，ab93295，Abcam；兔抗鼠人TOMM20一抗，1：250，ab186734，Abcam，AlexaFluor647驴抗兔二抗，1：200，ab150075，Abcam，Alexa488驴抗山羊二抗，abcam，ab150129，1：400，37℃，避光孵育2小时。PBS洗两次，每次5min。1：5000稀释Hoechst33342原液染核5min。PBS漂洗多余Hoechst33342染液，去除多余水份，防焠灭封片剂封片，4℃冰箱保存，正置荧光显微镜或者共聚焦显微镜拍摄。2.蛋白免疫印迹试验将小鼠骨髓单核细胞以2×106浓度铺入6孔板，以空白为对照组，免疫印迹蛋白分析技术检测0.5gmlmtDNA、氧化mtDNA刺激半小时后相关蛋白的表达。分析的蛋白包括：JMJD3，phospho-p38MAPK，p38MAPK,NF-κBp65，phospho-NF-κBp65，β-actin小鼠抗体。1取蛋白和蛋白定量：将处理0.5h的单核细胞用细胞刮收集细胞入1.5ml的EP管，1500rpm，离心5min后，PBS清洗3次。将残留PBS吸干，每管加入50μl细胞蛋白裂解液，冰上裂解30min，期间使用胰岛素针反复吹打。裂解30min后，在4℃，12000rpm离心15min，取上清，蛋白溶解在上清液内。用BCA试剂盒将提取后的上清液蛋白定量，调整各样品蛋白浓度一致，然后加入LoadingBuffer煮沸样品10min。2蛋白质电泳及转膜：上样，将制作好的样品蛋白质进行SDS-PAGE电泳分离。将蛋白质分离开的电泳胶取出待用，将甲醇浸泡激活后的PVDF膜覆盖在电泳胶上，待转膜用。装配转移“三明治”：海绵-4层滤纸-电泳分离胶-PVDF膜-4层滤纸-海绵，分离胶放置于负极面。100V，转膜1.5h。3孵育抗体及显色曝光：将转膜后的PVDF膜，浸没于封闭缓冲液中室温摇床封闭2h，TBST洗膜缓冲液洗膜3次，每次5min。加入稀释好的一抗兔抗小鼠phospho-p38MAPK抗体，Thr180Tyr182，#4511，CellSignallingTechnology；兔抗小鼠p38MAPK，#8690，CellSignallingTechnology；兔抗小鼠NF-κBp65，#8242，CellSignallingTechnology；兔抗小鼠phospho-NF-κBp65，#3033，CellSignallingTechnology；β-actin小鼠抗体，#ab179467，Abcam；兔抗小鼠JMJD3抗体，#GTX31466，GeneTex4℃孵育抗体过夜，根据蛋白marker确认目的蛋白的位置。TBST洗膜缓冲液洗膜3次，每次5min。37℃孵育二抗2h。TBST洗膜缓冲液洗膜3次，每次10min。以SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstate显色液反应3min后，吸走多余的反应液，在Bio-RadChemiDocImagingsystem化学发光仪显色曝光。3.实时荧光定量检测基因表达1细胞及组织总RNA的提取使用TIANGEN公司RNASimpleTotalRNAKit。培养细胞样品吸净培养基，按照1ml10cm2的量加入RZ裂解液，反复吹打后室温静置5min。组织样品置于研钵中加入液氮研磨成粉状，加入RZ裂解液，反复吹打后4℃，3000rpm离心取上清液。加入200μl氯仿，剧烈涡旋混匀15s，室温静置3min。将静置后的混合物于4℃12000rpm离心10min，此时样品分三层：下层黄色的有机相，中间层和上层透明的水相，RNA主要在上层水相，缓慢把水相转移到新管中。加入二分之一体积无水乙醇，涡旋混匀，将混合液体一起移入吸附柱CR3，于4℃12000rpm离心30sec，甩干收集管中废液。向吸附柱中加入500μl去蛋白液RD，于4℃12000rpm离心30sec，将收集管中废液丢弃，并将吸附柱放入新收集管中。在吸附柱中加入700μl漂洗液RW，于室温下静置2min，4℃12000rpm离心30sec，丢弃废液，重复加700μl漂洗液RW并离心。将吸附柱转移至新收集管中，4℃12000rpm离心2min，去除残余RW并晾干。将吸附柱转入新的RNasefree1.5ml离心管，将30-100μlRNase-freeddH2O加入吸附柱，室温静置2min，4℃12000rpm离心2min。测RNA提取浓度ngμl。2使用gDNA试剂盒Takara进行去除基因组DNA反应。体系如表1所示。将该体系混匀后，瞬离10sec，42℃反应2min。表1去gDNA反应体系3将去除gDNA后的混合物进行逆转录反应，程序37℃，15min；85℃，5sec；4℃，10min。表2逆转录反应体系4以步骤3所得样品为模板，进行qRT-PCR反应检测目的基因相对表达。反应体系如表3所示，程序如下：95℃，10min；95℃，1min，40×；60℃，1min；72℃，1min。实验涉及基因引物序列如表4所示。表3逆转录反应体系表4RT-PCR反应基因引物序列4.组织固定、石蜡包埋1取下的胰腺、肺组织浸泡于10倍体积的4％多聚甲醛溶液中固定，固定时长超过48h。2切取固定好的胰腺、肺组织，厚度四川大学JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途A190565K8SIPOSequenceListing1.0120DNA人工序列ArtificialSequence1acccagaagactgtggatgg20219DNA人工序列ArtificialSequence2acattgggggtaggaacac19320DNA人工序列ArtificialSequence3cccccatttcagctgactaa20419DNA人工序列ArtificialSequence4ctggaccaaggggtgtgtt19520DNA人工序列ArtificialSequence5ctgatgcccccatgttcgtc20624DNA人工序列ArtificialSequence6caccctgttgctgatgccaaattc24721DNA人工序列ArtificialSequence7tgttccctgtagcacatcaag21818DNA人工序列ArtificialSequence8tagagtgagtgcgtttcg18

权利要求：1.JMJD3抑制剂在制备防治胰腺炎的药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的药物是防治胰腺炎并发肺损伤的药物。3.如权利要求1或2所述的用途，其特征是：所述的胰腺炎为急性胰腺炎。4.如权利要求1～3任意一项所述的用途，其特征是：所述的胰腺炎由化学品导致。5.如权利要求4所述的用途，其特征是：所述的胰腺炎由左旋精氨酸和或雨蛙素导致。6.如权利要求1～5任意一项所述的用途，其特征是：所述的药物抑制由mtDNA和或氧化mtDNA诱导的JMJD3表达上调。7.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的JMJD3抑制剂为JMJD3特异性抑制剂。8.如权利要求1或7所述的用途，其特征是：所述的JMJD3抑制剂是式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：9.如权利要求1～8任意一项所述的用途，其特征是：所述的药物是以JMJD3抑制剂为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。10.如权利要求9所述的用途，其特征是：所述的制剂为口服制剂或注射制剂。

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