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申请/专利权人：南京农业大学

摘要：本发明提供一种用于检测猪肉肌内脂肪含量的SNP位点，所述SNP位点位于猪HOXA13基因转录起始位点上游1311bp处，所述SNP位点的基因型是GG、GT或TT。因此，将该SNP命名为g.‑1311GT。本发明还提供一种猪肉肌内脂肪含量的检测方法，通过提取待检测猪肉样品的DNA，然后对扩增片段进行分型，通过分型结果判断猪肉样品的肌内脂肪含量。本发明通过研究肌肉发育关键基因HOXA13与肌内脂肪含量的相关性，获得了一种检测猪肌内脂肪含量的方法，基于该方法可以有利于猪的选育，为进一步提高猪肉肌内脂肪含量、方便快速地判断猪肉肌内脂肪含量情况奠定基础，对优良肉质品种猪的培育具有重要意义。

主权项：1.SNP分子标记的检测试剂在检测猪肉肌内脂肪含量中的应用，其特征在于所述SNP分子标记的位点位于猪HOXA13基因的转录起始位点上游序列SEQIDNo.1的667bp处，所述SNP分子标记的位点的基因型是GG、GT或TT，当所述SNP分子标记的位点的基因型为GG型或GT型时，猪肉肌内脂肪含量高于TT型基因型。

全文数据：HOXA13基因启动子区SNP位点及其在检测猪肌内脂肪含量中的应用技术领域本发明属于分子生物学领域，具体涉及猪HOXA13基因启动子区SNP位点及其应用。背景技术随着人们生活水平的提高，肉的品质逐渐成为人们关注重点。肌内脂肪是分布于肌肉组织的白色脂肪，其含量的高低能从肌肉的嫩度、大理石纹、肌肉风味等多方面改变肌肉的品质。随着肌内脂肪含量的增加，肌纤维越细，肌纤维之间缔联的结缔组织也越少，肌肉的剪切力越低，肉的嫩度越好。肌内脂肪含量越高，肌肉大理石纹评分也升高。肌内脂肪含量越高，肌肉表面的脂质越丰富，油脂在肌肉表面形成的膜能够缓解钙蛋白酶受自由基攻击的程度，进而提高肌肉的持水力，减少滴水损失，提高肌肉的多汁性。此外，肌内脂肪含量还会影响肌肉的光反射值和蒸煮损失，对肌肉风味有较大影响。肌内脂肪含量受营养水平和遗传因素等控制。不同的品种的肌内脂肪蓄积能力通常存在差异；对于同品种的动物，营养状况越好越有利于积累肌内脂肪；肌内脂肪含量随年龄和体重的增加也会增加；耐力运动有利于肌内脂肪的积累。肌内脂肪的沉积与肌纤维的类型、肌肉生长速率和肌肉代谢类型相关，代谢旺盛的氧化型肌肉组织慢肌或红肌内，肌内脂肪沉积更多，酵解型纤维快肌或白肌则肌内脂肪沉积则较少，红肌通常高于白肌。同源异型盒基因Homeoboxgene，HOXgene是一类调控生物形体发育的基因，包括脊柱、泌尿生殖系统、中枢神经系统、四肢和肌肉等的发育。猪HOXA13基因属于HOX基因家族中的第一簇HOXA，位于猪的第18条染色体上。该基因的序列中含有一段180-183个碱基的保守序列，该保守序列编码构成一个共有60-61个氨基酸的多肽区域，称为同源结构域。它通过螺旋-转角-螺旋的结构特异性地结合DNA，并作为转录调控因子调节靶基因的表达，参与各种生物学过程。已知HOXA13在肢体的骨骼肌中强烈表达，能够调控肌细胞分化和发育有关的转录因子MyoD和Fhl1等的表达，对骨骼肌的发育过程发挥重要作用。HOXA13还在氧化型肌肉慢肌和酵解型纤维快肌中差异表达，是影响肌内脂肪含量的重要候选基因。该基因中肌内脂肪含量相关SNP位点的筛选及鉴定，能够为肉质的提高提供重要理论基础和依据，为猪优质肉品种的选育提供分子标记。发明内容本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种用于检测猪肉肌内脂肪含量的SNP位点，并提供基于该SNP位点的检测方法和育种方法，实现方便、快速地判断猪肉肌内脂肪含量情况，从而为优良肉质品种猪的培育提供依据。基于上述目的，本发明提供一种用于检测猪肉肌内脂肪含量的SNP位点，所述SNP位点位于猪HOXA13基因转录起始位点上游1311bp处，所述SNP位点的基因型是GG、GT或TT。因此，将该SNP命名为g.-1311GT。其中，猪HOXA13基因序列参见Chromosome18,NC_010460.445373340..45379046。另外，SEQNo.1为猪HOXA13基因部分序列，其中上游1311bp处为SNP位点，其基因型是GG、GT或TT。在本发明中，当所述SNP位点的基因型为GG型或GT型时，猪肉肌内脂肪含量高于TT型基因型，而GG型和GT型个体的肌内脂肪含量没有显著差异。进一步地，本发明还提供一种猪肉肌内脂肪含量的检测方法，所述方法包括以下步骤：1提取待检测猪肉样品的DNA；2以引物对HOXA13-F与HOXA13-RC、HOXA13-F与HOXA13-RA；对步骤1所得DNA进行PCR扩增，获得扩增片段；3通过AS-PCR的方法对扩增片段进行分型；4当分型结果为GG型或GT型时，判断其猪肉样品的肌内脂肪含量高于TT型的猪肉样品肌内脂肪含量。优选地，所述引物的序列为如SEQNo.2-4所示：HOXA13-F：5′-AGTGCCCTGGGAGTTTAG-3′，HOXA13-RC：5′-GGTCCTTGTCACTTGTGC-3′，HOXA13-RA：5′-GGTCCTTGTCACTTGTGA-3′。步骤2中PCR扩增反应20μL体系包括：2×rTaqMixture10μL、上下游引物各1μL、待检测DNA1μL、ddH2O7μL。PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。本发明还提供一种用于检测猪肉肌内脂肪含量的试剂盒，所述试剂盒含有引物对HOXA13-F与HOXA13-RC、HOXA13-F与HOXA13-RA，所述引物的序列为如SEQNo.2-4所示：HOXA13-F：5′-AGTGCCCTGGGAGTTTAG-3′，HOXA13-RC：5′-GGTCCTTGTCACTTGTGC-3′，HOXA13-RA：5′-GGTCCTTGTCACTTGTGA-3′。进一步地，所述试剂盒还含有rTaqMixture2×和ddH2O。本发明还提供一种选育高肌内脂肪猪的方法，所述方法包括选育猪HOXA13基因转录起始位点上游1311bp为GG型或GT型的个体。本发明通过研究肌肉发育关键基因HOXA13与肌内脂肪含量的相关性，提供了一个与猪肌内脂肪含量相关的SNP位点，从而获得了与肌内脂肪含量相关的功能基因和分子遗传标记，为进一步提高猪肉肌内脂肪含量奠定基础，为方便快速地判断猪肉肌内脂肪含量情况奠定基础，对优良肉质品种猪的培育具有重要意义。附图说明图1HOXA13基因转录起始位点上游1311bp处SNP突变位点模式；其中，左图突变位点为G，中间图突变位点为GT，右图突变位点为T图2突变位点基因型GG、GT和TT对应肌内脂肪含量比较。具体实施方式以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案，对于未注明具体条件的实验方法通常按照本领域的公知常识。在本发明中，如无特殊说明，用于描述浓度的“％”的重量百分比，“：”为重量比，“份”为重量份。实施例1一、样品肌内脂肪含量测定采用230头皮特兰×杜洛克×约克夏×大白四元杂交商品猪，实验动物由温氏集团提供，采自苏食集团规模屠宰场。所有实验动物在同一条件下饲养，屠宰后迅速采集背最长肌，分别进行以下步骤：1将9cm中速定量滤纸分散放在干净的搪瓷盘中，105℃烘2h。用电子分析天平进行称量，滤纸的重量记为W1；2取背最长肌2～3g左右肉样，切碎，用烘干的滤纸包好称重，纸包湿重记为W2；3将纸包摊开在搪瓷盘中，谨防接触，烘箱65℃烘15h，烘干后纸包称量记为W3，65℃、2h烘至恒重；4烘干后纸包放入索氏抽提器，加入无水乙醚回流一次，再次浸过纸包过夜，第二天打开水浴锅开始抽提，70℃回流9h以上；5取出纸包，在搪瓷盘中晾30min，使乙醚挥发充分，105℃烘2h称重，反复几次至恒重，纸包的称重记为W4；6为消除各样品处理过程中水分含量不等带来的误差，用抽提的脂肪总量与最后样品恒重的百分比表示肌内脂肪相对含量。计算公式为：肌内脂肪含量％＝[W3-W4W3-W1]×100％二、肌肉DNA的提取对前述的各实验动物分别进行以下步骤：1剪下100mg左右样品，切碎，放到2.0mLEP管内；2往EP管中分别加裂解液1mL和蛋白酶K50μL充分混匀，水浴锅内55℃水浴消化12h至过夜，次日向2.0mL管中加Tris饱和酚900μL，摇匀器上混匀15min，4℃，12000rpm离心15min；3吸取1000μL上层液体放入2mLEP管内，加氯仿异戊醇体积比24：1500μL和500μL饱和酚，摇匀器上混匀15min，4℃；12000rpm离心15min；4吸取850μL上层液体放入2mLEP管中，加氯仿异戊醇体积比24：1850μL，摇匀器上混匀15min，4℃，12000rpm离心15min；4吸取700μL上层液体放入2mLEP管中，加氯仿700μL，摇匀器上混匀15min，4℃，12000rpm离心15min；5吸取500μL上层液体放入1.5mLEP管中，加2倍体积无水乙醇，轻轻摇晃后，4℃，10000rpm离心10min；6弃去上层液体，加1mL70％无水乙醇，轻轻摇晃，4℃，10000rpm离心5min；7倒掉上层液体，除去管内剩余液体，超净台吹干至EP管内无水滴，干燥时间约25min；8样品加50μL55℃去离子水，使DNA完全溶解，进行样品质量检测，最后放入-20℃冰箱保存。采用NanoDrop分光光度计测定所得样品DNA浓度，计算OD260OD280比值判定DNA提取质量。当样品OD260OD280比值应为1.8～2.0时，则说明该DNA的提取质量是合格的。三、SNP位点检测1引物设计合成依据GenBank数据库猪基因序列HOXA13Chromosome18,NC_010460.445373340..45379046，设计包含相应HOXA13启动子测序引物HOXA13-1F和HOXA13-1R、HOXA13-2F和HOXA13-2R、HOXA13-3F和HOXA13-3R和用于AS-PCR分型的AS-PCR引物HOXA13-F，HOXA13-RC，HOXA13-RA。引物序列见表1。表1猪HOXA13基因引物设计信息2PCR反应体系和程序本实施例所使用的PCR反应体系如表2：表2PCR反应体系PCR反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s、X退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min结束；X＝57℃、57℃、57℃、60℃然后进行琼脂糖电泳检测：扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，电压130V，电泳约25min之后，用凝胶成像系统进行观察AS-PCR的分型结果。3SNP位点的筛选随机选取12个DNA样品作为模板，分别利用引物HOXA13-1F和HOXA13-1R、HOXA13-2F和HOXA13-2R、HOXA13-3F和HOXA13-3R对HOXA13基因启动子区域进行扩增，得到猪HOXA13基因转录起始位点上游共约2000bp左右片段，然后将PCR产物进行测序由苏州金唯智公司提供测序服务。测序结果表明HOXA13基因转录起始位点上游1311bp处存在一处单核苷酸碱基突变，分别为鸟嘌呤G或胸腺嘧啶T，如图1所示，该SNP命名为g.-1311GT。HOXA13基因启动子区部分序列见附录1，其中，从末位碱基向前数第1311bp即为HOXA13基因转录起始位点上游1311bp处-1311bp，该位点存在鸟嘌呤G或胸腺嘧啶T多态。根据AS-PCR分型结果得出：GG基因型个体有159个，TT基因型个体有17个，CT杂合型有54个。表1HOXA13基因g.-1311GT位点基因型及频率对不同基因型个体进行肌内脂肪含量统计，并分析SNP与肌内脂肪含量的相关性。表2HOXA13基因g.-1318AG位点与脂肪性状的关联性注：不同字母表示差异显著PT位点转录因子结合位点的预测，预测结果如表3.表3HOXA13启动子区g.-1311GT位点转录因子预测碱基类型拟结合转录因子GPAX6T--结果表明：当HOXA13基因启动子区的g.-1311GT位点为G时，可能有转录因子PAX6与之结合，从而调控HOXA13基因的表达，进而影响肌肉中肌内脂肪的沉积。综上所述，本发明通过研究肌肉发育关键基因HOXA13与肌内脂肪含量的相关性，获得了一种检测猪肌内脂肪含量的方法，基于该方法可以有利于猪的选育，为进一步提高猪肉肌内脂肪含量奠定基础，为方便快速地判断猪肉肌内脂肪含量情况奠定基础，对优良肉质品种猪的培育具有重要意义。序列表南京农业大学HOXA13基因启动子区SNP位点及其在检测猪肌内脂肪含量中的应用19075.110SIPOSequenceListing1.011977DNARNA猪Susscrofa1agccgtgtctgacctgtatgtaaaacagccctcaagtcctcaggaactggggcctcgaac60cctaccctgtctctttgtcatcaggagttttacaatgtcgcttggaggaaggaagggggg120tgaaggggccggaaagtaacacaaaaatcgggtccctacagagacgggttctttagtttg180caaatggccagtcaggaggaggtaaactgggggcaaatcaatatttacccggagctacta240aaaaagcgggagggaaaaggcacactgggtgtgtgtatggggagcgggggatcatagaag300gttttattgggaaacacttgcattggtctgggcaaacccagagatgagggcggataaaag360ccggagcccagccttattggtctggacactccaggaagaccaggaaacttaaagagcaga420ctggggtggagggtaggggctggggatgttgcagtgccctgggagtttagggctgagtct480gcaatctgcgacaggagggcagattcacgcctggttgctcaccagtctgcctgggatgga540agggcagtactcttcccaaccttgatgttcctgtggaacgcacccactttcactttgaat600gcatgttccccttctgggcctctgaccagctcacagtgaccacaatcggagatggaagta660tgtgacgcccaagtgacaaggacccccagagcccctcaccaaaacatggtggctctccca720gcaccaacactccaccgcgctctcaggaaagggtcgcatttcccaggcacagagaaaaag780cttcttgggctagttcttgggcagaggaggaccgggcaccctctgcaggctggagaccgt840gctctccccagtgctctctgggggagggaggaacgcatggccccaaggagtccctttctc900ctgtcccaaaacagtgaaatagagagtgtccaggggcctggagagtcagctcctgcccag960gctcggtgaagcctcattaagccccccaaggggggatcgagtcccatctcagaacccaga1020tggggcctgtttctcttccaagacaggccagcctggctggagatgtgggagcactggaaa1080acgaagcgcagcgatcgctctctccctctcaaagtctccgaaggaggaagagttgtcact1140gggacccagtgaggaacagtctgtatacaaaagtgtgagtgcgtgaccagggagtacact1200tggctgtgtgcgtgagtctgtgtgggtgtgatgggtcgttctgagcctcccggcctaagg1260gcgagtgcaggacactgcccacccacacggtggacaaagaaggggaggaagctcctacat1320gcagtccaagctgtccagtggaacgtcctggaacccgggagccagacgcatccgcaaccc1380cccccccccaacacacacacagttcccctggaaagagagccacttcgcgacgccgtagaa1440gccgaaagcgcaagtgcccgtgctggcgtctcgctgcagaaagaggcgcggatacctgga1500aagaaaacagcgcccgaggccccaggaagcacccagcctggtctccgcgtcgcgtcttta1560ccatctttaccattcccatgcgtctgcagctttacctaacctgtcgttgccatcgcctca1620ggtcgcaagccccacagctcgcccgtcccctcccgccttacgctgctctgggccccgcag1680ggaccgggaagagaaggggagccgcggggaagtcgcccttccctccccgccccgccctca1740cggtcctccgcccccacccgcccgcatcccccgcctctcccctgggtgaatggtgcgctg1800ccgcgcggcgggcgctggcgctggggaaggcgcgggcggcggcggcggcggggacggcgg1860gtgcgcagagccgagccggggttggagccgcccgctttgcatacgccgtgggcggagcgg1920ggtgggggggccgggccaatgggcggccgcctggcgcgaccctgcggggcgcgatcc1977218DNARNA未知Unknown2agtgccctgggagtttag18318DNARNA未知Unknown3ggtccttgtcacttgtgc18418DNARNA未知Unknown4ggtccttgtcacttgtga18520DNARNA未知Unknown5agccgtgtctgacctgtatg20621DNARNA未知Unknown6gtgacaactcttcctccttcg21719DNARNA未知Unknown7acaggagggcagattcacg19820DNARNA未知Unknown8atggcaacgacaggttaggt20917DNARNA未知Unknown9ttgggcagaggaggacc171017DNARNA未知Unknown10cacggcgtatgcaaagc17

权利要求：1.一种用于检测猪肉肌内脂肪含量的SNP位点，其特征在于所述SNP位点位于猪HOXA13基因的转录起始位点上游1311bp处，所述SNP位点的基因型是GG、GT或TT。2.根据权利要求1所述的SNP位点在检测猪肉肌内脂肪含量中的应用，其特征在于当所述SNP位点的基因型为GG型或GT型时，猪肉肌内脂肪含量高于TT型基因型。3.一种猪肉肌内脂肪含量的检测方法，所述方法包括以下步骤：1提取待检测猪肉样品的DNA；2以引物对HOXA13-F与HOXA13-RC、HOXA13-F与HOXA13-RA；对步骤1所得DNA进行PCR扩增，获得扩增片段；3通过AS-PCR的方法对扩增片段进行分型；4当分型结果为GG型或GT型时，判断其猪肉样品的肌内脂肪含量高于TT型的猪肉样品肌内脂肪含量。4.根据强烈要求2所述的检测方法，其特征在于所述引物的序列为：HOXA13-F：5′-AGTGCCCTGGGAGTTTAG-3′，HOXA13-RC：5′-GGTCCTTGTCACTTGTGC-3′，HOXA13-RA：5′-GGTCCTTGTCACTTGTGA-3′。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤2中PCR扩增反应20μL体系包括：2×rTaqMixture10μL、上下游引物各1μL、待检测DNA1μL、ddH2O7μL。6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤2中PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。7.一种用于检测猪肉肌内脂肪含量的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有引物对HOXA13-F与HOXA13-RC、HOXA13-F与HOXA13-RA，所述引物的序列为：HOXA13-F：5′-AGTGCCCTGGGAGTTTAG-3′，HOXA13-RC：5′-GGTCCTTGTCACTTGTGC-3′，HOXA13-RA：5′-GGTCCTTGTCACTTGTGA-3′。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还含有rTaqMixture2×和ddH2O。9.一种选育高肌内脂肪猪的方法，其特征在于所述方法包括选育猪HOXA13基因转录起始位点上游1311bp为GG型或GT型的个体。

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