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申请/专利权人：中国人民解放军总医院第四医学中心

摘要：本发明公开了一种基于3D生物打印的肌－骨复合移植物，涉及生物工程技术领域，包括3D打印机和培养皿，3D打印机用于打印肌－骨复合移植物的复合结构，复合结构从外至内包括肌腹层、第一过渡层、肌腱层、第二过渡层和骨质层，肌腹层由肌肉干细胞和基质组成，第一过渡层由肌肉干细胞和肌腱细胞组成，肌腱层由肌腱干细胞和基质组成，第二过渡层由肌腱细胞和骨质细胞组成，骨质层由骨质细胞和基质组成，复合结构在培养皿中培养为肌－骨复合移植物，肌－骨复合移植物由上至下包括肌腹体、肌腱体和成骨体。采用本发明的技术方案能够利用3D打印预先打印好复合结构，再将复合结构进行体外培养，形成同时具备部分肌肉与骨骼且相互连接紧密的肌－骨移植物。

主权项：1.一种3D生物打印设备用于制备肌－骨复合移植物的方法，其特征在于：包括3D打印机和培养皿，所述3D打印机用于打印肌－骨复合移植物的复合结构，所述3D打印机包括细胞注射组件和微流控喷头，所述细胞注射组件包括连接筒，所述连接筒穿设有第一导料管、第二导料管和第三导料管，所述第一导料管的一端连通有第一进料筒，所述第二导料管的一端连通有第二进料筒，所述第三导料管的一端连通有第三进料筒，所述第一进料筒、所述第二进料筒和所述第三进料筒的管径相同，所述第一进料筒、所述第二进料筒和所述第三进料筒均设于所述连接筒的外侧，所述第一导料管、所述第二导料管和所述第三导料管的管径依次减小，所述第一导料管、所述第二导料管和所述第三导料管设于所述连接筒的一端相互连通，所述第三导料管设于所述第二导料管的内侧，所述第二导料管设于所述第一导料管的内侧，所述连接筒的出料口连接有出料管，所述细胞注射组件有三件，三件所述出料管均与所述微流控喷头连通，所述培养皿设于所述微流控喷头的正下方，所述培养皿内放置有低温承接板；通过所述3D打印机打印得到的肌－骨复合移植物复合结构从外至内包括肌腹层、第一过渡层、肌腱层、第二过渡层和骨质层，所述肌腹层由肌肉干细胞和基质组成，所述第一过渡层由肌肉干细胞和肌腱细胞组成，所述肌腱层由肌腱干细胞和基质组成，所述第二过渡层由肌腱细胞和骨质细胞组成，所述骨质层由骨质细胞和基质组成，所述复合结构在培养皿中体外培养形成肌－骨复合移植物，所述肌－骨复合移植物由上至下包括肌腹体、肌腱体和成骨体；其中，所述骨质层为网状交替结构，所述第二过渡层中的肌腱细胞和骨质细胞相互交替融合，所述第二过渡层用于连接所述骨质层和所述肌腱层，所述肌腱层和所述肌腹层均呈纵向排列，所述第一过渡层的肌腱细胞和肌肉干细胞相互交替融合，所述第一过渡层用于连接所述肌腱层和所述肌腹层；所述肌肉干细胞、肌腱细胞和骨质细胞外侧均包裹有仿生壳体，所述肌肉干细胞与仿生壳体之间填充有烟酰胺磷酸核糖转移酶、、、和，所述肌腱细胞与仿生壳体之间填充有PRP和HGF，所述骨质细胞与仿生壳体之间填充有BMP和；细胞注射组件有三件，三件出料管均与微流控喷头连通，三件细胞注射组件分别为细胞注射组件Ⅰ、细胞注射组件Ⅱ和细胞注射组件Ⅲ，利用细胞注射组件Ⅰ打印复合结构的骨质层，细胞注射组件Ⅱ打印复合结构的肌腱层，细胞注射组件Ⅲ打印复合结构的肌腹层，细胞注射组件Ⅰ和细胞注射组件Ⅱ打印复合结构的第二过渡层，细胞注射组件Ⅱ和细胞注射组件Ⅲ打印复合结构的第一过渡层；在细胞注射组件Ⅰ的第一进料筒、第二进料筒和第三进料筒内分别填装骨质细胞、骨质细胞生长基质和人工仿生骨膜，在细胞注射组件Ⅱ的第一进料筒、第二进料筒和第三进料筒内分别填装肌腱干细胞、肌腱细胞生长基质和静电纺丝打印仿生肌膜，在细胞注射组件Ⅲ的第一进料筒、第二进料筒和第三进料筒内分别填装肌肉干细胞、肌肉细胞生长基质和人工肌膜，肌肉细胞生长基质包括烟酰胺磷酸核糖转移酶、、、和，培养皿放置在微流控喷头的正下方，且在培养皿内放置有低温承接板；开始打印时，利用3D打印机的控制系统，先打印骨质层，仅将细胞注射组件Ⅰ的出料管与微流控喷头连通，打印得到呈网状交替结构的骨质层；然后同时或交替将细胞注射组件Ⅰ和细胞注射组件Ⅱ的出料管与微流控喷头连通，打印得到肌腱细胞和骨质细胞相互交替融合的第二过渡层；接着仅将细胞注射组件Ⅱ的出料管与微流控喷头连通，打印得到呈纵向排列的肌腱层；接着同时或交替将细胞注射组件Ⅱ和细胞注射组件Ⅲ的出料管与微流控喷头连通，打印得到肌腱细胞和肌肉干细相互交替融合的第一过渡层，最后仅将细胞注射组件Ⅲ的出料管与微流控喷头连通，打印得到呈纵向排列的肌腹层；第二过渡层将骨质层和肌腱层连接起来；第一过渡层连接肌腱层和肌腹层，在纵向打印肌腱层和肌腹层的过程中，根据打印得到的肌－骨复合移植物的实际需要倾斜培养皿，使得培养皿内的骨质层与肌腱层、肌腱层与肌腹层之间具有倾斜角度，对肌腱层和肌腹层的打印过程具有导向作用，得到的复合结构稳定；最后在培养皿内，由下到上依次为低温承接板、骨质层、第二过渡层、肌腱层、第一过渡层和肌腹层；打印得到复合结构后，将复合结构在培养皿内培养，培养的条件及方法：向培养皿中加入PBS溶液、0.25%浓度的胰蛋白酶和10%浓度的胎牛血清，之后向培养皿中加入盐酸，调节培养液的pH值在7.2~7.4，之后放入无菌处理后的孵箱中，调节孵箱中的空气环境，使的浓度为5%，并处于饱和湿度状态，调节温度在36.5℃~37.5℃，待复合结构的细胞传代培养之后，开始对细胞进行计数和检测，最后复合结构在培养皿中体外培养形成肌-骨复合移植物，肌－骨复合移植物由上至下包括肌腹体、肌腱体和成骨体。

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百度查询： 中国人民解放军总医院第四医学中心 一种基于3D生物打印的肌-骨复合移植物