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申请/专利权人：浙江大学

申请日：2021-12-31

公开（公告）日：2023-12-08

公开（公告）号：CN114540299B

专利技术分类：...来自血液或免疫系统的细胞[2010.01]

专利摘要：一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，属于生物细胞提取技术领域。本发明通过物理方法除掉胃黏膜组织的黏膜上皮层和黏膜下层，留下免疫细胞富集的固有层进行消化处理，同时全程添加5μMBFA来抑制胃黏膜上皮细胞分泌黏液，通过双重手段阻止胃黏膜分泌的黏液影响单细胞提取。

专利权项：1.一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，取胃黏膜组织，用温度4℃的D-Hanks缓冲液清洗多次，洗去残留的分泌物和胃液；步骤2，用刮刀刮去胃黏膜组织表面的黏液；步骤3，称取1g胃黏膜组织，将其置于50ml离心管内，并加入10ml温度4℃的D-Hanks缓冲液，然后将离心管置于振荡器内进行振荡清洗5S；若D-Hanks缓冲液浑浊，则再次振荡清洗；步骤4，用弯剪将胃黏膜组织的黏膜下层剪去；步骤5，用吸水纸将去除黏膜下层的胃黏膜组织表面残留的液体吸去，并剪碎至0.5平方厘米的组织碎片；步骤6，将组织碎片置于装有10ml预消化缓冲液的50ml离心管内，以37℃、转速150rpm的条件在摇床上消化15min；步骤7，将50ml离心管从摇床取下，置于振荡器内进行振荡10S，去除悬浮在预消化缓冲液内呈絮状碎片的黏膜上皮层；然后，利用100μm的筛网，用不含钙镁离子的PBS缓冲液反复冲刷洗涤组织碎片；接着，将组织碎片置于50ml离心管内，并装入温度4℃的D-Hanks缓冲液，然后将50ml离心管置于振荡器内进行振荡清洗5S；若D-Hanks缓冲液浑浊，则再次振荡清洗，直至黏膜上皮层被完全清除；步骤8，将组织碎片置于1.5ml离心管内，在消化液的缓冲下剪碎至糊状，消化液的总体积为10ml，然后以37℃、转速150rpm的条件在摇床上消化30min；步骤9，利用70μm的筛网过滤，用添加有1%浓度bsa的不含钙镁离子的PBS缓冲液反复冲洗，协助单细胞滤过筛网，用50ml离心管收集滤过的单细胞悬液，弃去筛网上残余未被消化的纤维结缔组织及死细胞团块；收集完成后，在50ml离心管内加入添加有1%浓度bsa的不含钙镁离子的PBS缓冲液至40ml，然后将50ml离心管离心，离心机升9降9，转速450G，温度4℃，离心时间10min；步骤10，离心后，用3ml添加有1%浓度bsa的不含钙镁离子的PBS缓冲液重悬，然后过40μm的筛网，弃去筛网上残余组织，滤过的细胞悬液收集入15ml离心管后离心，离心机升9降9，转速450G，温度4℃，离心时间5min；步骤11，将2ml70%浓度percoll滴加在15ml新的离心管中，将3ml40%浓度percoll重悬细胞沉淀后，缓慢滴加在2ml70%浓度percoll的上方，再用3ml40%浓度percoll重悬离心管管底残留细胞，然后将15ml离心管置于离心机离心，离心机升3降1，转速450G，温度20℃，离心时间25min；步骤12，吸取最上层的细胞层，弃去；吸取中间细胞层，即为免疫细胞层，将其转移至15ml离心管内，加满不含钙镁离子的PBS缓冲液后离心，离心机升9降9，转速500G，温度4℃，离心时间5min；步骤13，弃去上清液，用不含钙镁离子的PBS缓冲液重悬后得到纯净的胃黏膜免疫单细胞悬液；所述预消化缓冲液由以下体积百分含量的各物质组成：4%的FBS；2%的1MHEPES；1%的0.5MEDTA；1%的0.1MDTT；91.99%的D-Hanks缓冲液；0.01%的50MMBFA；所述D-Hanks缓冲液、不含钙镁离子的PBS缓冲液、预消化缓冲液和消化液中均添加有5μMBFA。

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