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申请/专利权人：江苏海洋大学

摘要：本发明公开了嗜水气单胞菌OmpTS和Aha1亚单位疫苗的制备方法及应用，首先进行嗜水气单胞菌OmpTS和Aha1的重组表达载体构建，其次是进行重组蛋白的诱导表达及纯化，最后将纯化后的蛋白与佐剂MONTANIDETMISA763AVG进行乳化混合制备疫苗；针对嗜水气单胞菌选取其两种外膜蛋白OmpTS和Aha1通过重组表达来制备亚单位疫苗，疫苗抗原是基因表达产物，而不是具有毒性的菌体，相比灭活疫苗相比具有很高的安全性；疫苗成分单一，本身不具备毒性，不会存在毒力恢复的情况；疫苗所用抗原为蛋白质不会发生可能出现的基因重组问题，利用表达菌株BL21DE3可以大量生产蛋白，同时本发明提供了两种蛋白最佳的表达条件，可以更高效的制备目的蛋白，具有大规模使用的潜力。

主权项：1.嗜水气单胞菌OmpTS和Aha1亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：S1：嗜水气单胞菌OmpTS和Aha1的重组表达载体构建与转化；S11：设计引物：根据嗜水气单胞菌OmpTS基因序列GenBank登录号：AF276639.2及Aha1基因序列GenBank登录号：AY165026.1预测其跨膜结构及信号肽位置并且设计引物；S12：目的基因的克隆；挑取低温保存的嗜水气单胞菌接种于LB液体培养基中，置于28℃恒温摇床，培养12h后，取10mL菌液，8000g，离心10min收集菌体；使用《细菌基因组DNA提取试剂盒》提取菌体DNA，将提取的DNA作为模板扩增目的基因，通过PCR扩增出目的基因，其反应条件为94℃预变性5min，94℃预变性1min，56℃预变性1min，72℃预变性2min，共30个循环，最后72℃延伸10min，通过凝胶电泳检测扩增效果；PCR反应体系如下：成分和体积为10×buffer为1.0μL；dNTP为0.4μL；F为0.2μL；R为0.2μL；Taq酶为0.15μL；细菌DNA为1.5μL；ddH2O为6.55μL；Total为10.0μL。S13：构建重组质粒；琼脂糖凝胶电泳分离出的目的条带，使用AxygenDNA凝胶回收试剂盒回收目的基因OmpTS和Aha1，并构建重组质粒T-OmpTS和T-Aha1；构建重组质粒的反应体系为：5μL2×buffer，1μLTvector，3μL胶回收产物，1μLT4连接酶；反应条件为：23℃反应30min，置于4℃过夜，将构建好的质粒转入trans5α并鉴定；S131：取10μL连接产物加入大肠杆菌trans5α，温和混匀，冰浴静置30min，42℃水浴热激90s，再立即冰浴静置3min；S132：取80μL转化后的菌液加入到800μLLB培养基中，37℃，180rpm，培养1h，恢复菌体抗药性；S133：向含卡那霉素的LB琼脂平板培养基上加入40μLX-gal、5μLIPTG、200μL菌液，避光均匀涂布；S134：将平板置于恒温培养箱培养16h，再置于4℃培养使蓝色充分显现，挑取白色菌落置于含氨苄的LB液体培养基中，37℃，180rpm，培养8h；S135：取适量菌液作为模板进行PCR验证，并将阳性克隆测序；S14：构建重组表达载体；将测序检测后的菌液扩培，使用《TianGEN高纯度质粒小提中量试剂盒》提取质粒，并检测其浓度，再进行重组质粒与pET-28a的分别双酶切，并电泳检测酶切效果，胶回收构建完成的重组表达载体pET-28a-OmpTS和pET-28a-Aha1；载体与质粒双酶切体系的成分和体积如下：10×TangoBuffer的体积为6μL；T-OmpTSpET-28a的体积为30μL；BamHI的体积为0.2μL；XhoI的体积为0.2μL；ddH2O的体积为23.6μL；Total的体积为60μL；反应条件：37℃过夜；载体与质粒连接体系的成分和体积如下：10×T4DNALigaseBuffer的体积为0.5μL；PEG400的体积为0.5μL；T4DNALigase的体积为0.5μL；OmpTS酶切产物的体积为3μL；pET-28a酶切产物的体积为1μL；xTotal的体积为5.5μL；反应条件：23℃反应30min，4℃连接过夜；S15：重组表达载体转化感受态细胞BL21DE3；按照转化trans5α的方法将重组表达载体转入表达菌株BL21DE3；S2：重组蛋白的诱导表达及纯化；S21：重组蛋白表达条件筛选IPTG诱导浓度；将阳性克隆菌按1：20接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600＝0.6时，加入不同终浓度的IPTG，分别在37℃培养8h，通过SDS-PAGE检测表达情况；S22：重组蛋白纯化；根据最佳表达条件，扩大菌液培养体积，大量表达重组蛋白并纯化；S221：用0.5％TritonX-100重悬包涵体沉淀，室温震荡30min后离心10min，4℃，10000g，弃上清，取沉淀；S222：沉淀以等体积的1M尿素溶解，室温震荡30min后离心10min，4℃，10000g，；S223：沉淀以等体积的2M尿素溶解，室温震荡30min后离心10min，4℃，10000g；S224：沉淀以等体积的4M尿素溶解，室温震荡30min后离心10min，4℃，10000g；S225：沉淀以适量8M尿素溶解过夜；S226：离心10min，4℃，10000g，弃沉淀，取上清；S227：将含目的蛋白的8M尿素稀释至4M；S228：纯化后的蛋白加入蛋白酶抑制剂后，4℃保存；S3：嗜水气单胞菌OmpTS和Aha1亚单位疫苗制备；纯化的蛋白与佐剂MONTANIDETMISA763AVG按照重量比3：7进行乳化混合，并检测乳化效果；乳化后的疫苗的乳液滴径均一；将乳化后的疫苗进行4℃保存，以备使用；S4：嗜水气单胞菌OmpTS和Aha1亚单位疫苗免疫保护效果评估；S41：监测疫苗免疫保护率；在攻毒后观察14d，每天统计各组死亡率，计算免疫保护率；免疫保护率RPS＝1-免疫组死亡率对照组死亡率×100％S43：通过荧光定量qrt-pcr分析免疫相关基因表达量变化及细菌相对丰度；S44：通过酶联免疫吸附试验ELISA检测嗜水气单胞菌特异性抗体IgM+水平；S45：检测抗菌酶活性；测定抗菌酶的活性，采用相应的酶活性检测试剂盒南京建成生物工程研究所，南京，中国检测溶菌酶LZM、碱性磷酸酶AKP和酸性磷酸酶ACP的活性。

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