买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：中国计量大学

摘要：本发明公开了一种闭管可视化检测大肠杆菌E.coliO157:H7的试剂盒和方法。本发明的试剂盒包括位于检测管内的混合反应体系和位于检测管管盖上的巯基DNA修饰后的金纳米颗粒，其中管内混合反应体系包含相互混合的RPA扩增体系和保护DNA修饰化的CRISPRCas12a反应体系，检测管管盖上的巯基DNA修饰化金纳米颗粒混合液可在闭管情况下加入到混合反应体系中。本发明通过DNA‑crRNA复合体的设计，将RPA体系、CRISPR体系和金纳米颗粒置于同一管中，形成闭管检测体系防止交叉污染的产生。

主权项：1.一种闭管可视化检测大肠杆菌E.coliO157:H7的试剂盒，其特征在于包括位于检测管内的混合反应体系和位于检测管管盖上的巯基DNA修饰后的金纳米颗粒混合液；其中，所述检测管内混合反应体系包括相互混合的RPA扩增体系和保护DNA修饰后的CRISPRCas12a反应体系；所述RPA扩增体系用于对大肠杆菌E.coliO157:H7基因组中的特异性基因片段进行RPA扩增，包括引物RPA-F、引物RPA-R、Primer-Free-Rbuffer、DNA模板、RNAase-freewater和醋酸镁；所述RPA-F的序列如SEQIDNo.1所示，RPA-R的序列如SEQIDNo.2所示；所述CRISPRCas12a反应体系包括：Cas12a、DNA-crRNA复合体、Linker-ssDNA、bufferC、ddH2O；其中所述DNA-crRNA复合体由保护DNA链与crRNA配对形成，能够在37℃下解链并缓慢释放crRNA与大肠杆菌E.coliO157:H7基因组中的特异性基因片段上的目标DNA进行结合；所述保护DNA链的序列如SEQIDNo.3所示，且保护DNA设计茎环结构，保护DNA前16个碱基序列与crRNA特异性序列的16个碱基进行碱基互补配对，后8个碱基在解链后与保护DNA链前8个碱基能够互补形成茎环结构；当体系在37℃下反应一定时间后，DNA-crRNA复合体会逐渐发生解链释放crRNA，DNA链自己形成茎环结构并保证防止在解链后再与crRNA互补形成复合体；所述检测管盖上巯基DNA修饰后的金纳米颗粒包括AuNPs-DNA1、AuNPs-DNA2和饱和氯化钠溶液；其中AuNPs-DNA1和AuNPs-DNA2为将两条不同序列巯基DNA修饰到金纳米颗粒形成，其中，两条巯基DNA与混合反应体系中的Linker-ssDNA互补；所述管盖上的巯基DNA修饰后的金纳米颗粒混合液设置在管盖的下表面，能够在检测管封闭的情况下加入到所述混合反应体系内。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国计量大学 一种闭管可视化检测大肠杆菌E.coli O157:H7的试剂盒和方法