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申请/专利权人：广州普世利华科技有限公司

摘要：本发明公开一种快速检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）进行安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。此方法提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，并在37～42℃恒温条件下、20min内实现柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的检测，特异性为100％，非常适用于现场快速检测。与普通PCR方法相比，RDA荧光法是在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短。因此，本发明的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，为柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。

主权项：1.一种多重检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应试剂、阳性对照和阴性对照；所述恒温扩增反应试剂包括重组酶KX60-600ngμL、KY蛋白16-192ngμL、单链结合蛋白gp32100-1000ngμL、链置换DNA聚合酶3-100ngμL、逆转录酶200U、核酸外切酶30～200U、肌酸激酶0.1-0.8mgml、磷酸肌酸25-75mM、Tris缓冲液20～100mM、PEG2.5％-10％、醋酸钾或醋酸钠0-150mM、dATP1-5mM、dNTPs150-600nM、DTT1-12mM、探针150nM-600nM和引物对150-600nM；所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1和2所示，其中SEQIDNO.1的探针用于检测柯萨奇病毒A16型CA16，SEQIDNO.2的探针用于检测肠道病毒71型EV71，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2中5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5位碱基位置用四氢呋喃残基THF替代，其具体信息如下：SEQIDNO.1：5’-FAM-CTGGT[THF]AGGTTGGTGCAGTTCTGACGCACC-BHQ1-3’；SEQIDNO.2：5’-FAM-CAGTG[THF]GTGGTGTGTCGTAACGGGCAACTC-BHQ1-3’；所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；靶标序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；所述的恒温扩增反应试剂为冻干粉试剂；所述重组酶KX的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示，所述KY蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。

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