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申请/专利权人：中国农业科学院油料作物研究所

摘要：本发明公开了一种基于13C代谢全位标记脂质作为内标结合同位素稀释质谱法的全脂质定量方法，该方法是利用生物代谢合成13C代谢全位标记脂质，并结合同位素稀释质谱法建立的一种全脂质一对一绝对定量方法。其特征在于利用13C全标记底物（如CO2、葡萄糖或碳酸（99%）等）作为唯一碳源加入到诸如微生物、细胞、植物和动物培养基或膳食等中，通过生物代谢过程制备大量高标记效率的13C标记（全位标记）脂质；然后将这些标记脂质作为内标，结合同位素稀释质谱法对实际生物样本中脂质进行一对一的定量分析。本发明具有制备过程简单、可操作性强、定量准确性高、线性动态范围广等优点，同时解决了目前商业化同位素标记脂质标准品缺乏且价格昂贵的难题。

主权项：1.一种基于13C代谢全位标记脂质结合同位素稀释质谱法的糖脂定量方法，其特征在于包括如下步骤：1）将13C全标记底物作为唯一碳源加入生物培养基或膳食中通过生物代谢制备13C全位标记脂质，并提取13C全位标记脂质；同时以含12C碳源的普通培养基或膳食培养生物制备12C脂质，并提取12C脂质；所述12C碳源与13C全标记底物为同一物质，区别仅在于未进行13C标记；2）利用超高效液相色谱串联质谱对步骤1）所提取的12C脂质、13C全位标记脂质进行脂质组学数据采集；液相分离条件：色谱柱为KinetexC18色谱柱；流动相：A相为甲醇乙腈水，体积比1:1:1；B相为异丙醇乙腈，体积比5:1，A相和B相皆含5mmolL的醋酸铵；质谱分析条件：在正电喷雾电离和负电喷雾电离模式下进行数据采集，模式为数据依赖型采集模式，在正离子模式下，MS参数为：去簇电压设置为80V，碰撞能量设置为30V，离子喷射电压设置为+5500V，质量范围为50~1200mz；离子源的气体1和气体2设置为50psi；在负离子模式下，去簇电压设为−80V，碰撞能量设为−30V，离子喷射电压设为−4500V，质量范围为50~1200mz；3）利用数据库谱图匹配和同位素理论偏差对12C脂质和13C全位标记脂质定性分析和13C标记效率计算；其中，13C全位标记脂质的定性分析通过对应12C脂质保留时间以及13C引入导致的一级质谱分子离子和二级质谱碎片离子mz差进行定向判断，同时mz的偏差在5ppm内；13C全位标记脂质的标记效率通过同位素模式分布模拟软件进行模拟计算所得，且标记效率在95%以上；4）对实际待测样本中脂质进行提取，按照步骤2）和3）进行数据采集和脂质定性分析，获得实际样本中脂质的种类信息；其中，12C脂质标准品与相应13C全位标记脂质的提取离子色谱峰时，均选择分析物一级分子离子mz对应单同位素峰和全标记同位素峰的提取离子色谱峰；5）以待分析实际样本和13C标记脂质中都存在的脂质的标准品配置成不同浓度的梯度标准溶液，以13C全位标记脂质作为内标等量加入梯度标准溶液中，建立以12C脂质标准品的浓度为横坐标，以12C脂质标准品与相应13C全位标记脂质的提取离子色谱峰面积之比为纵坐标的每一类脂质的同位素稀释质谱校准曲线；6）在对实际样本中脂质定量分析时，加入与步骤4）中等量的13C全位标记脂质作为内标，同时加入已知浓度的氘代脂质内标，将目标脂质与对应13C全位标记脂质内标的峰面积比代入其同位素稀释质谱校准曲线，从而获得实际样本中目标脂质的绝对含量； 13C代谢标记对象为通过摄入13C全标记底物后通过生物代谢替换原有12C的生物；所述13C全标记底物包括CO2，葡萄糖或碳酸盐；目标脂质为糖脂。

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