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申请/专利权人：上海海洋大学

摘要：本发明公开了hoxa1a基因敲除斑马鱼突变体的构建方法和应用，通过CRISPR技术构建，依次包括设计gRNA位点—PCR扩增—gRNA的模板纯化—体外转录—gRNA纯化—显微注射—检测敲除效率—饲养至成鱼—与野生型交配—检测下一代胚胎是否携带突变位点—饲养成年后剪尾鉴定出杂合突变体—两杂合体交配得到纯合突变体的步骤。本发明首次利用CRISPR技术构建hoxa1a基因敲除斑马鱼突变体，其可作为动物模型用于研究hoxa1a基因在心脏发育过程中的作用以及为治疗Bosley‑Salih‑Alomainy综合征提供基础。

主权项：1.hoxa1a基因敲除斑马鱼纯合突变体在构建与hoxa1基因敲除综合征相关的动物模型中的应用；所述hoxa1基因敲除综合征为hoxa1a基因敲除斑马鱼纯合突变体出现心脏发育缺陷疾病相关表型，hoxa1a--纯合突变体第3天时心室有变大现象并且心室心肌层变厚，一个月的hoxa1a--纯合突变体出现心包腔肿大、流出道血管平滑肌增厚和心室心肌层增厚的异常表型；所述hoxa1a基因敲除斑马鱼纯合突变体通过CRISPR技术构建，依次包括设计gRNA位点—PCR扩增—gRNA的模板纯化—体外转录—gRNA纯化—显微注射—检测敲除效率—饲养至成鱼—与野生型交配—检测下一代胚胎是否携带突变位点—饲养成年后剪尾鉴定出杂合突变体—两杂合体交配得到纯合突变体的步骤，包括以下步骤：1获取斑马鱼的hoxa1a基因序列；2在斑马鱼hoxa1a基因的第一个外显子上设计如SEQIDNO：1所示的靶点gRNA序列；3设计并合成hoxa1a基因的gRNA引物F1和R1，序列分别如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示；4设计并合成hoxa1a基因的检测引物F2和R2，序列分别如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示；5使用步骤3的gRNA引物、gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增反应，电泳检测PCR产物后，纯化；所述PCR反应条件为：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火65℃30s，延伸72℃30s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃；6上述PCR纯化产物在RNase-Free条件下进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP于37℃反应1.5h，纯化；7将步骤6纯化后的gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到斑马鱼单细胞期的胚胎中，Cas9蛋白的终浓度800ngμL，gRNA的终浓度100ngμL，注射量为1nL，24h后取胚胎提取DNA，用F2R2这对引物对敲除位点进行PCR扩增，用TAKARAT7E1酶进行酶切统计敲除效率，将敲除成功的小鱼饲养长大，作为F0；所述PCR反应条件为：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃40s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃；所述T7E1酶切检测反应体系如下：PCR产物5μL、Buffer21.1μL、ddh2O4μL，反应条件为：95℃-30s，85℃-5min，4℃∞，反应后加0.25μLT7E1酶37℃水浴45min，电泳检测；8待F0斑马鱼性成熟后与野生型的斑马鱼杂交，得到杂合子，取胚胎提取DNA，并用F2R2这对引物对敲除位点进行PCR扩增，用T7E1酶检测PCR产物突变效率并测序确认，将有突变的斑马鱼培养长大，作为F1；9待F1斑马鱼性成熟后，将雌鱼和雄鱼的鱼尾切除进行尾鳍DNA提取，进行PCR扩增，测序确认后有突变的斑马鱼PCR产物和19T载体相连接，经过转化和蓝白斑筛选挑选白色菌落进行摇菌，通过菌液PCR鉴定并挑选阳性菌液，测序确认每条鱼的突变类型，具有相同突变类型的雌雄斑马鱼进行配对，即得。

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