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申请/专利权人：中国海洋大学三亚海洋研究院;青岛大螠海创生物科技有限公司

摘要：本发明涉及遗传育种领域，具体涉及一种单环刺螠无损伤DNA提取方法，其具体是从单环刺螠的尾刚毛、体表粘液及体腔液中提取基因组DNA样本，对所提取的DNA进行验证，以确定所提取的DNA样本的最低用量，实现单环刺螠无损伤的DNA提取方法，所提取的DNA样本经检测符合遗传育种所需；经过后期养殖，采集过尾刚毛样本的单环刺螠成螠存活率为100%；刮取体表粘液的单环刺螠成螠存活率为100%，采集体腔液的单环刺螠成螠存活率为100%，幼螠存活率为89.67%；有效保障试验对象可继续应用于生产，为推动单环刺螠遗传育种研究和优良品种选育工作奠定基础。

主权项：1.单环刺螠无损伤DNA提取方法，其特征在于：选取从单环刺螠的尾刚毛、体表粘液及体腔液中提取基因组DNA样本，对所提取的DNA进行验证，以确定所提取的DNA样本的最低用量，具体操作如下：第一步：样本采集从所述尾刚毛提取DNA样本：使用无菌手术剪剪取每只单环刺螠成螠裸露在体外的尾刚毛，其不含毛囊；使用无菌镊子拔取每只单环刺螠成螠完整的尾刚毛，其含毛囊；从所述体表粘液提取DNA样本：用干净卫生纸蘸取单环刺螠成螠体表多余水分，用灭菌塑料板轻轻刮取体表，将其分泌的体表粘液转移到1.5mL的灭菌离心管中；从所述体腔液中提取DNA样本：取出单环刺螠成螠，待其收缩时，用普通1mL注射器，针头型号26G；垂直体壁方向扎进身体中部，针头进入身体0.5cm，缓慢拉动活塞即可吸取体腔液；幼螠使用胰岛素注射器，针头型号34G；吸取体腔液，待幼虫呈收缩状态时，选取没有肠道的一侧体壁垂直将针头插入体腔中，缓慢拉动活塞吸取其体腔液；第二步：细胞计数将采集的单环刺螠成螠100倍体腔液稀释液和幼螠体腔液用血球计数板在显微镜下进行计数，最后根据计数室体积和稀释倍数计算成螠和幼螠体腔液血细胞数；第三步：DNA提取选取第一步中所剪取的尾刚毛与成螠完整尾刚毛，成螠体表粘液，成螠体腔液与幼螠体腔液，使用DNA提取试剂盒提取DNA；第四步：采集样本后的个体，置于原养殖环境中继续养殖；第五步：存活率检测。

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