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申请/专利权人：艾美荣誉(宁波)生物制药有限公司

摘要：本发明涉及狂犬病毒疫苗细胞各组分DNA比例检测技术领域，具体为一种狂犬病毒疫苗Vero细胞DNA残留检测方法，包括以下步骤：DNA提取、液滴生成、制备微滴、PCR扩增及数据读取与分析，其中，DNA提取包括以下步骤：细胞裂解、结合、分离、洗涤及脱离，通过对磁珠进行吸附提取时，改变试管的震荡方式，由传统的试管水平回旋式震荡调整为试管倾斜旋转摆动震荡，使得位于试管底部的磁珠随着震荡被浮起，进而被玻璃棒套吸附，使得Vero细胞DNA尽可能多的被吸附提取与纯化，进而提高Vero细胞DNA残留检测的精度，避免检测结果出现偏差。

主权项：1.一种狂犬病毒疫苗Vero细胞DNA残留检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤a、DNA提取，裂解提取人用狂犬病毒疫苗Vero细胞的原液样品中的DNA进行纯化，具体包括以下步骤：步骤s1、细胞裂解，利用含有裂解缓冲液的混合物来打破Vero细胞，释放出其中的核酸及蛋白质；步骤s2、结合，将裂解后的样本与磁珠混合装入试管1内，将所述试管1竖直插设于震荡装置2上，在所述试管1内插入玻璃棒套3，所述震荡装置2带动所述试管1进行震荡时，通过所述玻璃棒套3的搅拌使得磁珠在所述试管1内分布均匀，磁珠通过表面涂覆的亲和DNA的分子与DNA结合；步骤s3、分离，将带有磁性的磁棒4插入到所述玻璃棒套3内，所述震荡装置2带动所述试管1进行摆动，使得所述试管1呈倾斜，且其中心轴线绕所述玻璃棒套3圆周摆动设置，所述磁棒4吸附磁珠，完成DNA的分离处理；步骤s4、洗涤，向磁珠添加洗涤缓冲液，去除非特异性结合或者残留的杂质，并利用磁力重复洗涤步骤，在每次完成洗涤后移除洗涤液；步骤s5、脱离，DNA充分洗涤后，通过添加离子溶液或低盐缓冲液，使DNA从磁珠上脱落，并进入溶液中；步骤b、体系建立，以步骤s5的DNA为模板，加入狂犬病毒的糖蛋白基因的引物及荧光探针来建立PCR反应体系；步骤c、制备微滴，将建立好的PCR反应体系加入至微滴生成板中与微滴生成油生成微滴，并封膜；步骤d、PCR扩增，将包含成微滴的PCR板放置在PCR仪器中进行循环扩增，以便对每个微滴内的DNA进行复制；步骤e、数据读取与分析：循环完成后，使用专用的读取器来读取每一滴的荧光信号，然后通过软件进行分析，以得出含有目标DNA的微滴的数量，利用ddPCR提供的绝对定量能力，通过计算检测到的阳性微滴数目来估算疫苗中Vero细胞DNA的残留量。

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