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申请/专利权人：福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院);西安交通大学

摘要：本发明公布了一种基于cfDNA碱基突变频率分布检测肝癌特异突变的方法，是对血液中的基因突变筛选策略，不需要依赖肿瘤组织取样，完全无创性的肿瘤突变检测方案，用于精确性筛选肿瘤来源突变。通过收集肿瘤患者的手术前血液样本与手术后血液样本，分别提取cfDNA进行高通量UMI测序。经过高精度的序列处理与合并后，分别对每个血液样本进行突变检测。鉴定突变后，使用所有体细胞突变在手术前后两个时间点的频率变化对不同类型基因突变进行分群。然后对筛选到的肿瘤来源突变进行整合，筛选出的肿瘤来源特异突变可以进一步用于时间序列样本的肿瘤负荷动态评估。

主权项：1.一种基于cfDNA碱基突变频率分布检测肝癌特异突变的装置，用于对高通量测序文库进行测序，高通量测序文库采用以下步骤建立：步骤1.从已提取的受试者的血浆中提取cfDNA；步骤2.对步骤1提取的cfDNA的进行末端修复并在cfDNA的3’端添加A碱基，在处理后的cfDNA两端连接测序带有分子标签UMI的截短型Y型接头，得到连接产物，并对连接产物进行磁珠纯化，用含有用于区分不同样本的index标签序列的引物进行扩增富集并磁珠纯化，加入带有生物素标记的探针进行杂交反应，用带有链和亲酶素标记的磁珠对文库进行洗脱，捕获生物素标记的核酸分子，并扩增和磁珠纯化，构建高通量测序文库；其特征在于，基于cfDNA碱基突变频率分布检测肝癌特异突变的装置包括以下执行模块，得到受试者的cfDNA的突变频率分布：模块一.对原始序列文件中的UMI读段进行提取，分离每个读段两端各3个碱基的UMI信息，将提取出的UMI信息加到读段名字中进行保存后，将读段中UMI信息从原始序列中切除，得到UMI提取后的测序读段，将UMI提取后的测序读段与人类参考基因组进行比对；模块二.用bwa提取所有比对到人类参考基因组同样位置的所有UMI提取后的测序读段，若测序读段的UMI信息相同，但碱基排列不一致，则去除该UMI信息的测序读段；若多个测序读段的UMI信息相同，且碱基排列一致，则标记为共通序列并保留；若只1个测序读段的UMI信息相同，且碱基排列一致，则标记为孤立序列并保留；模块三.对孤立序列进行降噪后回收，与共通序列合并，形成最终的输出bam文件；对孤立序列进行降噪后回收包括：计算所有只有孤立序列的人类参考基因组位置的碱基分布，基于二项分布评估测序噪声的大小，当对应孤立序列的碱基分布与人类参考基因组位置的主要碱基不一致，且碱基频率小于噪声时，将该孤立序列舍弃，否则则被回收；模块四.使用iDES算法将bam文件转化为碱基频率分布文件，然后使用人类参考基因组的参考数据集对碱基频率分布文件进行抛光，得到降噪之后的碱基频率分布；模块五.用PBMC的测序数据作为对照样本，对模块四处理后的数据进行突变频率检测，去除假阳性突变，得到受试者的cfDNA的突变频率分布；模块五中突变频率检测中认定为突变的条件是：同时从正负双链对测序读段进行突变频率检测覆盖时有大于2个突变读段，或只从正链负链对测序读段进行突变频率检测覆盖时有大于1个突变读段，同时突变频率大于-log0.01depth，在对照样本中测序出的突变频率频率小于0.005；模块六：按模块一~五检测肿瘤患者术前cfDNA的突变频率分布和同种肿瘤组织样本的突变频率分布，鉴定其中重叠的部分，并比较重叠部分的突变频率分布，选取重叠部分的突变频率分布的下四分之一分位数，作为频率阈值；然后按模块一~五检测肿瘤患者术后cfDNA的突变频率分布，基于得到的频率阈值对肿瘤患者术前和术后cfDNA的突变频率分布，及进行过滤，得到筛选后的突变频率分布，计算突变频率变化比率，并绘制峰图。

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