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摘要：本发明涉及家蚕血液免疫黑化研究技术领域，且公开了一种家蚕血液免疫黑化中PO和DDC作用差异研究方法，包括以下步骤：S101、配置试剂；S102、病原物的处理与侵染；S103、家蚕基因提取；S104、家蚕cDNA链合成；S105、定量PCR分析；S106、PPO酶活性测定；S201、配置试剂；S202、病原物的侵染与抑制剂的注射；S203、酚氧化酶与多巴脱羧酶酶活性的检测；S204、表型观察；S205、定量PCR分析；S206、测定实验。该家蚕血液免疫黑化中PO和DDC作用差异研究方法，为了了解酚氧化酶与多巴脱羧酶的蛋白酶活性对于血液黑化的影响，分别用两种酶的特异性抑制剂来对家蚕进行注射并研究，进而对比出PO和DDC家蚕血液免疫黑化中的影响作用。

主权项：1.一种家蚕血液免疫黑化中PO和DDC作用差异研究方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、病原体选择S101、配置试剂用分析天平称取NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g，将药品倒入锥形瓶中，加入800mlddH2O，搅拌均匀直至完全溶解，使用盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH值至7.4，然后用容量瓶定容至1000ml，放高压灭菌锅灭菌后放4℃备用，用分析天平称取1mg左旋多巴样品，用1ml灭菌水稀释为1mgml制成母液备用，放4℃备用，用分析天平称取1mgLPS样品，用1ml灭菌水稀释为1mgml制成母液备用，放4℃备用，将无水乙醇与DEPC水按75：25的比例用移液器加入至RNasefree离心管中，于-20℃存放备用，配制出LB液体培养基与LB固体培养基进行备用，称取氯化钠0.54g，柠檬酸一水0.43g，氢氧化钠0.20g，EDTA0.25g，调节pH至4.5，加ddH2O定容至50mL，转入瓶中高压灭菌后4℃保存备用；S102、病原物的处理与侵染取出冻存的菌液加入新鲜加入600ulLB液体培养基，37℃、220rpm活化12h，取200ul活化后的菌液加入20mlLB液体培养基中过夜培养，将过夜培养的原始菌液进行1到1000倍的梯度稀释后取100ul涂布于LB无抗平板，37℃倒置培养12h后选择菌落数在30-300之间的平板进行计数，按照公式：原始菌液浓度＝菌落数×稀释倍数×10CFUml计算原始菌液浓度为1.24×109CFUml，使用前离心收集菌体，用PBS重悬为2×108CFUml，4℃保存备用，注射时每头蚕注入5ul，合1X106CFU头，参照大肠杆菌，最终得到原始菌液浓度为6.5×107CFUml，使用前离心收集菌体，用PBS重悬为2×108CFUml，4℃保存备用，注射时每头蚕注入5ul，合1×106CFU头，刮取生长适龄期的白僵菌孢子于0.05％吐温-80中，菌悬液用四层灭菌后的擦镜纸过滤，将其中较大的菌丝除去，利用血细胞计数板进行孢子计数，计算孢子悬液浓度为8.2×107孢子ml，进一步用0.05％吐温-80稀释至1×107孢子ml，注射时每头蚕注入5ul，即5×104孢子头，用磁珠振荡破坏培养的金黄色葡萄球菌液，然后在4℃下以800g离心10分钟获得上清液，在通过在4℃下以13000g离心10分钟，从培养的上清液中获得沉淀，然后用0.5％SDS轻轻重悬沉淀，在60℃中孵育30分钟，并在室温下以13000g离心10分钟，用ddH2O洗涤收集的沉淀以去除SDS，然后将沉淀用含有10mMCaCl2的1MTris-HCl重悬，用于胰蛋白酶处理，在37℃下孵育12小时，孵育后，通过以13000g离心10分钟收集沉淀，然后用含有1MNaCl的1MTris-HCl洗涤，然后用ddH2O洗涤三次，残留物用浓盐酸在37℃下处理12小时，然后通过13000g离心10分钟收集不溶性Lys型PG，残留物再次用ddH2O洗涤5次，最后放-20℃保存，随机挑选生长发育状况基本相同的5龄3天D9L品系家蚕90头，分组进行病原物侵染，用微量注射器吸取制备好的待注射液5ul，采用气孔注射法从家蚕的气孔注入家蚕体内，注射前需要用75％的酒精给注射器消毒，并用无菌水润洗干净；S103、家蚕基因提取用取血针扎穿实验用蚕的第一对腹足,并将血液收集至装有等量抗凝血剂的RNasefree离心管中备用，取出待测血浆，加入600μL裂解液，试剂剧烈震荡15min后，4℃静置30min，于12000rpm，4℃离心15min，将上清转入新的1.5mLRNasefree离心管内，加入200-250μL提前预冷的氯仿，剧烈震荡1min，4℃静置15min，于12000rpm，4℃离心15min，将上清吸入新的1.5mLRNasefree离心管内，加入与吸取上清液等量的提前预冷的异丙醇，颠倒混匀5-6次，-20℃静置30min，12000rpm，4℃离心20min，弃上清后，加入1mL预冷过的75％乙醇悬浮沉淀，涡旋振荡1min，12000rpm，4℃离心15min，弃上清，重复上述操作一次，弃上清后，倒置晾干，加入50μL的DEPC水溶解沉淀，进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，紫外分光光度计测定RNA浓度；S104、家蚕cDNA链合成使用PCR仪进行配制反转录体系，使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否具有BmActin3基因条带；S105、定量PCR分析根据定量引物设计原则设计出基因序列的引物，在家蚕基因组数据库中检验引物的特异性，选择具有高度特异性的引物送公司合成，qPCR反应以家蚕BmActin3基因为内参；S106、PPO酶活性测定量取50μL待测血液，加入3mLPBS缓冲液与0.01molL的L-3，4-二羟基苯丙氨酸，混合均匀，用酶标仪在490nm波长下，测定1min内吸光度的增大值，6次重复，酶活力单位用U表示，1U＝A49050μLmin；S2、抑制酶活性对家蚕血液免疫黑化的效果分析S201、配置试剂按步骤S101中的方法配制出PBS缓冲液、左旋多巴溶液、无水乙醇以及抗凝血缓冲液，用分析天平称取0.0022g卡比多巴样品，用1ml灭菌水稀释为10mM制成母液备用，放4℃备用，用分析天平称取0.0016g苯基硫脲样品，用1ml灭菌水稀释为10mM制成母液备用，放4℃备用，用分析天平称取0.001g苯基硫脲样品，用1ml灭菌水稀释为1mgml制成母液备用，放-20℃备用，用分析天平称取KH2PO42.72g，将药品倒入锥形瓶中，加入800mlddH2O，搅拌均匀直至完全溶解，使用盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH值至4.5，然后用容量瓶定容至1000ml，放高压灭菌锅灭菌后放4℃备用，称取氯化钠0.54g，柠檬酸一水0.43g，氢氧化钠0.20g，EDTA0.25g，苯基硫脲0.0821g，调节pH至4.5，加ddH2O定容至50mL，转入瓶中高压灭菌后4℃保存备用；S202、病原物的侵染与抑制剂的注射根据步骤S102，对大肠杆菌进行处理，随机挑选生长发育状况基本相同的5龄3天D9L品系家蚕90头，分组进行病原物侵染，用微量注射器吸取制备好的待注射液5ul，采用气孔注射法从家蚕的气孔注入家蚕体内，注射前需要用75％的酒精给注射器消毒，并用无菌水润洗干净，在注射大肠杆菌后5.5h后,分别注射稀释后的卡比多巴溶液、苯基硫脲溶液以及PBS；S203、酚氧化酶与多巴脱羧酶酶活性的检测量取50μl待测血淋巴，加入3mlPBS缓冲液与0.01molL的L-3，4-二羟基苯丙氨酸，混合均匀，用酶标仪在490nm波长下，测定1min内吸光度的增大值，6次重复，酶活力单位用U表示，1U＝A49050μLmin，称取1mg样本，用甲醇配成1mgml的母液备用，随后用超纯水分别稀释为0.5μgml、1μgml、2μgml、5μgml、10μgml、15μgml，将配置的标品超声20min，过0.22μm滤膜，HPLC上机检测，检测器为DAD紫外检测器，高效液相色谱仪配备HypersilTMODSC18色谱柱和DAD紫外检测器，检测条件：流动相100％甲醇︰1‰HAC溶液＝20︰80，流速1mLmin，柱温30℃，上样量10μL，检测波长为280nm，吸取适量已收集的待测家蚕血淋巴于离心管中，加入适量苯基硫脲溶巴溶液，于37℃恒温培养箱里孵育30分钟，随后煮沸2分钟，加入氯仿后涡旋充分混匀，于12000rpm，4℃离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，于HPLC上机检测；S204、表型观察每种试剂注射10头5L3d的家蚕,在注射大肠杆菌5.5h后注射相应试剂，然后于0.5h后取家蚕血液，吸取各组等量已收集的待测家蚕血淋巴于离心管中，于37℃恒温培养箱静置孵育0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h、24h，拍照取样，每种试剂注射10头5L3d的家蚕,在注射大肠杆菌5.5h后注射相应试剂，然后于0.5h后取家蚕血液，用正视显微镜看血细胞形态表征；S205、定量PCR分析根据步骤S103，提取RNA，随后根据步骤S104对家蚕的cDNA链进行合成，并根据步骤S105进行定量PCR分析，实用2^-ΔΔCt法处理分析数据，计算基因间的相对表达水平；S206、测定实验吸取200μL待测血淋巴，用酶标仪在490nm波长下，测定吸光度，3次重复，测定黑色素含量，取5龄3天的家蚕血液并相应加入E.coli与PBS、PTU和Carbidopa，于室温下孵育3h后涂无抗固体培养基，过夜培养15h计数拍照，取家蚕5L3D血液，离心提取血细胞并放于grace培养基内保存，并相应加入Ni-NTA琼脂糖珠与PBS、Carbidopa溶液以及多巴胺溶液，于室温下加入大肠杆菌菌液孵育2h后于荧光倒置显微镜下观察血细胞包封情况，取家蚕5L3D血液，离心提取血细胞并放于grace培养基内保存，并相应加入E.coli与PBS、PTU和Carbidopa，于室温下孵育3h后于荧光倒置显微镜下观察血细胞吞噬情况并计数。

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