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申请/专利权人：上海鲁奥生物工程技术有限公司

摘要：本发明公开了一种用于体外诱导脐血源NK细胞的扩增方法。主要包括以下步骤：步骤一、从脐带血中分离出单个核细胞；步骤二、从单个核细胞中分选出CD3+标记的T淋巴细胞，并收集剩余的单个核细胞；步骤三、NK细胞的培养和扩增；步骤四、细胞数量及细胞表型鉴定。本发明利用磁珠分选法分选出单个核细胞中以CD3+标记的T淋巴细胞，用剩余成份诱导培养NK细胞，从源头筛除了因CD3+细胞占比过高而影响NK细胞诱导及培养的限制因素，增加了NK细胞诱导的成功率，且扩增培养到14天的NK细胞流式检测CD3‑CD56+细胞比例可达到90％以上，符合临床级制备要求，在体内外均显现出良好的抗肿瘤活性。

主权项：1.一种体外诱导脐血源NK细胞扩增的方法，其特征在于，在不同的培养时期使用不同的培养基，第-1至第6天，使用诱导培养基，诱导培养基为无血清培养基添加硫酸庆大霉素注射液和IL-2；第7天，当CD3-CD56+的流式结果达到50％以上时，开始使用增殖培养基，增殖培养基的配置为诱导培养基中加入IL-12和IL-15；所述方法具体包括以下步骤：步骤1：从人新鲜脐血中分离出脐血单个核细胞；步骤2：将步骤1中分离出的单个核细胞用磁珠分选法分选出CD3+标记的T淋巴细胞，并获得剩余单个核细胞；步骤3：根据计数结果取预定接种量的剩余单个核细胞到离心管中，将滋养层细胞A1复苏后用生理盐水重悬，两管离心后备用；步骤4：将步骤3中分离出的细胞沉淀和滋养层细胞A1用诱导培养基混匀后接种到培养瓶中，加入5％的FBS，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内诱导培养，接种当天记录为-1天；步骤5：第3天：换液，将培养瓶中的细胞悬液吸入离心管中离心后用诱导培养基重悬，加入FBS；步骤6：4-6天补液；步骤7：第7天：取样计数做流式检测，调整细胞浓度，检测CD3-CD56+细胞比例达到50％以上时，加入增殖培养基重悬的滋养层细胞A2，并用增殖培养基补液，进行扩增培养；步骤8：第8天转袋：NK细胞在培养瓶中培养一段时间，细胞数达到一定数量，此时培养基含量超过300mL，加入增殖培养基调整细胞浓度，且要将细胞转入到2L的悬浮培养袋中继续进行培养；步骤9：第14天：取样计数做流式检测，调整细胞浓度，检测CD3-CD56+细胞比例达到90％以上；步骤10：第15-16天：收集NK细胞悬液，计数冻存。

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