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申请/专利权人：南京羚诺生物医药技术研究院有限公司

摘要：本发明提供了一种普兰林肽的制备方法，属于肽合成技术领域，解决了在合成普兰林肽的时候，随着肽链长度的增加，容易引起错误的累积，降低了总体产率的问题。本发明包括S1分段、S2合成前准备、S3制备肽链一、S4制备肽链二、S5制备肽链三、S6制备肽链四、S7合并前预处理、S8合并、S9折叠和S10后处理；本发明通过将普兰林肽的氨基酸序列划分为四个具体段落，针对每一段的特定氨基酸特性进行优化合成，使得可以分别控制每一段的合成条件，从而降低由于氨基酸相互作用导致的副反应；本发明通过固相合成法与微波辅助技术相结合，显著减少了合成所需的时间。

主权项：1.一种普兰林肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1分段：选择氨基酸序列为KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPTNVGSNTY-（NH2）的肽链作为目标肽链，编号为SEQIDNO.1；其中，A代表丙氨酸；C代表半胱氨酸；F代表苯丙氨酸；G代表甘氨酸；H代表组氨酸；I代表异亮氨酸；K代表赖氨酸；L代表亮氨酸；N代表天冬酰胺；P代表脯氨酸；Q代表谷氨酰胺；R代表精氨酸；S代表丝氨酸；T代表苏氨酸；V代表缬氨酸；Y代表酪氨酸；（NH2）代表目标肽链的最后一个酪氨酸的C端以游离酰胺形式存在；将编号为SEQIDNO.1的目标肽链分成肽链一、肽链二、肽链三和肽链四，肽链一的氨基酸序列为KCNTATCATQ，编号为SEQIDNO.2；肽链二的氨基酸序列为RLANFLVHSS，编号为SEQIDNO.3；肽链三的氨基酸为NNFGPILP，编号为SEQIDNO.4；肽链四的氨基酸序列为TNVGSNTY-（NH2），编号为SEQIDNO.5；S2合成前准备：选择RinkAmideMBHA树脂作为固相树脂；将RinkAmideMBHA树脂置于旋转器中，加入二甲基甲酰胺进行旋转作业，使RinkAmideMBHA树脂完全膨胀；然后采用二甲基甲酰胺对膨胀后的RinkAmideMBHA树脂进行清洗；清洗结束后，用过滤或离心的方式去除RinkAmideMBHA树脂，最后使用氮气吹干；依据目标肽链的氨基酸序列包含的氨基酸类型，选择Fmoc保护的氨基酸作为合成目标肽链的氨基酸；去除溶液配制：去除溶液由20%的哌啶和80%的二甲基甲酰胺组成，用于去除保护基作业中，去除保护基作业具体为使用去除溶液去除Fmoc保护的氨基酸N端的Fmoc保护基，然后交替使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷清洗，确保完全去除残留物；最后利用氮气吹干；采用反相高效液相色谱设备进行纯化作业；配置肽合成终止稳定溶液：肽合成终止稳定溶液包括冰醋酸、二甲基甲酰胺和二氯甲烷，按照重量比，冰醋酸:二甲基甲酰胺:二氯甲烷为1-1.1:8:1-1.1；裂解液配制：裂解液1包括二苯甲硅烷、三甲基硅烷、三氟乙酸、纯水和乙撑二硫醚，按照重量比，二苯甲硅烷:三甲基硅烷:三氟乙酸:纯水:乙撑二硫醚为2.3-2.5:0.05-0.1:90-92:2.4-2.5:0.05-0.1；裂解液2包括三氟乙酸、纯水和三苯甲基三嗪，按照重量比，三氟乙酸:纯水:三苯甲基三嗪为95:2.4-2.5:2.4-2.5；裂解液3为三氟乙酸、纯水和三异丙基硅烷的混合物，按照重量比，三氟乙酸:纯水:三异丙基硅烷为90-92:2.4-2.5:2.4-2.6；利用微波辅助技术，采用微波合成辅助设备，以缩短耦合和去除保护基作业的时间；S3制备编号为SEQIDNO.2的肽链一：按照肽链一氨基酸序列逆序的方向，通过逐步耦合的方式合成肽链一；在合成肽链一过程中，采用N-甲基吡咯烷酮和二甲基甲酰胺作为耦合溶剂；采用1-羟基-7-偶氮苯并三唑作为活化剂，采用六氟磷酸六乙基铝铵作为耦合剂；在每次添加新的Fmoc保护的氨基酸前，使用去除溶液对上一个Fmoc保护的氨基酸进行去除保护基作业，以确保下一个Fmoc保护的氨基酸能够在正确的位置进行耦合；在每次耦合和去除保护基作业中，采用微波合成辅助设备加快反应；S4制备编号为SEQIDNO.3的肽链二：按照肽链二氨基酸序列逆序的方向，通过逐步耦合的方式合成肽链二；在合成肽链二过程中，采用N-甲基吡咯烷酮和二甲基甲酰胺作为耦合溶剂；采用1-羟基苯并三唑为活化剂，采用六氟磷酸偶氮苯三唑四甲基脲作为耦合剂；采用二异丙基碳二亚胺作为辅助添加剂；在每次添加新的Fmoc保护的氨基酸前，使用去除溶液对上一个Fmoc保护的氨基酸进行去除保护基作业，以确保下一个Fmoc保护的氨基酸能够在正确的位置进行耦合；在每次耦合和去除保护基作业中，采用微波合成辅助设备加快反应；S5制备编号为SEQIDNO.4的肽链三：按照肽链三氨基酸序列逆序的方向，通过逐步耦合的方式合成肽链三；在合成肽链三过程中，采用二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮作为耦合溶剂；采用1-羟基-7-偶氮苯并三唑为活化剂，采用六氟磷酸偶氮苯三唑四甲基脲作为耦合剂；在每次添加新的Fmoc保护的氨基酸前，使用去除溶液对上一个Fmoc保护的氨基酸进行去除保护基作业，以确保下一个Fmoc保护的氨基酸能够在正确的位置进行耦合；在每次耦合和去除保护基作业中，采用微波合成辅助设备加快反应；S6制备编号为SEQIDNO.5的肽链四：按照肽链四氨基酸序列逆序的方向，通过逐步耦合的方式合成肽链四，在合成肽链四过程中，采用N-甲基吡咯烷酮和N,N-二甲基乙酰胺作为耦合溶剂；采用1-羟基苄唑作为活化剂，采用六氟磷酸六乙基苯并三嗪作为耦合剂；在每次添加新的Fmoc保护的氨基酸前，使用去除溶液对上一个Fmoc保护的氨基酸进行去除保护基作业，以确保下一个Fmoc保护的氨基酸能够在正确的位置进行耦合；在每次耦合和去除保护基作业中，采用微波合成辅助设备加快反应；S7合并前预处理：分别将制备的编号为SEQIDNO.2的肽链一、编号为SEQIDNO.3的肽链二、编号为SEQIDNO.4的肽链三和编号为SEQIDNO.5的肽链四依次进行真空干燥作业、活化处理作业、溶解作业、和减压浓缩作业，得到肽链一溶液、肽链二溶液、肽链三溶液和肽链四溶液；在溶解作业中采用6M盐酸胍的二甲基甲酰胺作为溶剂；在活化处理作业中，具体活化对象为肽链一的C端，肽链2的N端；肽链三的C端和肽链四的N端；采用1-羟基苯并三唑作为活化剂，活化处理作业的环境温度为在0°C至5°C的温度；S8合并：在合并过程中，采用1-羟基苯并咪唑和1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐作为耦合剂，采用4-二甲氨基吡啶作为催化剂；具体合并步骤如下：S8.1合并肽链一和肽链二:在肽链一溶液中加入耦合剂和催化剂，随后将肽链二溶液滴加到肽链一溶液中进行耦合反应，在耦合反应中通过取样进行薄层层析和反相高效液相色谱分析，监控耦合反应的进展；反应完成后，将反应后的溶液用冷乙腈沉淀，随后进行离心操作，以回收反应产物；将回收的反应产物，使用反相高效液相色谱设备，采用梯度洗脱的方式进行纯化作业，收集符合序列为KCNTATCATQRLANFLVHSS的A肽链，编号为SEQIDNO.6；S8.2合并肽链三和肽链四：在肽链三溶液中加入耦合剂和催化剂，随后将肽链四溶液滴加到肽链三溶液中进行耦合反应，在耦合反应中通过取样进行薄层层析和反相高效液相色谱分析，监控耦合反应的进展；反应完成后，将反应后的溶液用冷乙腈沉淀，随后进行离心操作，以回收反应产物，将回收的反应产物，使用反相高效液相色谱设备，采用梯度洗脱的方式进行纯化作业，收集符合序列为NNFGPILPTNVGSNTY-（NH2）的B肽链，编号为SEQIDNO.7；S8.3合并A肽链和B肽链：分别将制备的A肽链和B肽链四依次进行真空干燥、活化处理、溶解、和减压浓缩作业，得到A肽链溶液和B肽链溶液，在溶解作业中采用6M盐酸胍的二甲基甲酰胺作为溶剂；在活化处理作业中，具体活化对象为A肽链的C端，B肽链的N端；在A肽链溶液中加入耦合剂和催化剂，随后将B肽链溶液滴加到A肽链溶液中进行耦合反应，在耦合反应中通过取样进行薄层层析和反相高效液相色谱分析，监控耦合反应的进展；反应完成后，将反应后的溶液用冷乙腈沉淀，随后进行离心操作，以回收反应产物，将回收的反应产物，利用反相高效液相色谱设备，采用梯度洗脱的方式进行纯化作业，收集符合序列为KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPTNVGSNTY-（NH2）的目标肽链；S9折叠：将收集的目标肽链溶解在折叠缓冲液中，进行折叠作业；折叠缓冲液包括氢氧化三羟甲基氨基甲烷、二硫苏糖醇、氧化谷胱甘肽、硫酸镁和纯水，在折叠缓冲液液中，氢氧化三羟甲基氨基甲烷的浓度为80-100mM；二硫苏糖醇的浓度为3-5mM；氧化谷胱甘肽的浓度为0.2-0.5mM；硫酸镁的浓度为5-7mM；将折叠后的的目标肽链依次经过离心分离作业、透析作业、离子交换色谱初纯化作业和反相高效液相色谱纯化作业，收集经过折叠后的目标肽链；S10后处理：将折叠后的目标肽链依次经过冷冻作业和次气相干燥作业，然后在干燥、无湿气和冷藏的环境中保存。

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