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申请/专利权人：奥明星程(杭州)生物科技有限公司

摘要：本发明提供一种高效且适于不同接头连接的微量cfDNA建库方法及试剂盒，所述建库方法包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、PCR标签模块处理和测序与分析模块处理；本发明所述方法构建文库的效率显著提升，较商业化试剂盒提高1倍；不同起始量样本，文库产出均一性高；兼容不同结构接头，包括Illumina平台Y型接头和Hairpin接头，以及MGI平台Bubble接头，均可高效连接；保留更多原始模板，分析指标偏好性低。

主权项：1.一种高效且适于不同接头连接的微量cfDNA建库方法，其特征在于，包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、PCR标签模块处理和测序与分析模块处理；所述末端修复模块处理的具体操作如下：A1将cfDNA样本吹打混匀3-5次，吸取1ng至PCR管中，用无核酸酶水补足体积至50ul；B1将末端修复缓冲液解冻，末端修复酶混合物颠倒混匀，瞬时离心，置于冰上备用；所述末端修复缓冲液为1×的T4多聚核苷酸激酶缓冲液、20mM的ATP、20mM的dATP和2mM的dNTP组成的混合物；或者1×的NEB2缓冲液、20mM的ATP、20mM的dATP和2mM的dNTP组成的混合物；C1在cfDNAPCR管中，按如下体积加入试剂： 组分 体积ul 样本 25-50 末端修复缓冲液 3.5-7 末端修复酶混合物 1.5-3 总计 30-60 D1吹打混匀20次，瞬时离心收集至管底；E1将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应，热盖105℃，20℃30min，65℃30min，4℃保存；F1反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，放置冰上，并立即进行下一步实验；所述接头连接模块处理具体操作如下：A2将连接缓冲液解冻，快速连接酶颠倒混匀，瞬时离心后将试剂置于冰上备用；DNA接头原液稀释60倍；B2在样本管中配制如下反应： 组分 体积ul 末端修复产物 60 连接缓冲液 30 快速连接酶 10 DNA接头 10 总计 110 C2吹打混匀20次，瞬时离心收集至管底；D2将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应，热盖105℃，20℃15min；E2反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，放置冰上；F2使用DNA磁珠对反应产物进行纯化；所述PCR标签模块处理具体操作如下：A3将PCR扩增引物预混液和高保真聚合酶预混液解冻后颠倒混匀，于灭菌PCR管中配制如下反应： 组分 体积ul 上一步纯化产物 20 PCR扩增引物预混液 2.5-10 高保真聚合酶预混液 12.5-50 总计 50 B3吹打混匀20次，瞬时离心收集至管底；C3将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应： D3反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，放置冰上；E3使用DNA磁珠对反应产物进行纯化。

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