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申请/专利权人：复旦大学附属肿瘤医院;北京橡鑫生物科技有限公司

摘要：本申请涉及cfDNA富集的技术领域，具体公开了一种基于生物素双探针的尿液中cfDNA富集方法。该方法包括以下步骤：S1、使得目标cfDNA和生物素双探针链霉亲和素磁珠杂交，得到捕获有cfDNA的生物素双探针链霉亲和素磁珠；S2、洗涤捕获有cfDNA的生物素双探针链霉亲和素磁珠；S3、将捕获有目标cfDNA的生物素双探针链霉亲和素磁珠加热变性，孵育后，回收得到目标cfDNA；生物素双探针链霉亲和素磁珠包括链霉亲和素磁珠、双生物素标记探针BP1和双生物素标记探针BP2。本申请的方法能够高效富集尿液样本中的小片段cfDNA。

主权项：1.一种基于生物素双探针的尿液中cfDNA富集方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、使得目标cfDNA和生物素双探针链霉亲和素磁珠杂交，得到捕获有cfDNA的生物素双探针链霉亲和素磁珠；S2、洗涤捕获有cfDNA的生物素双探针链霉亲和素磁珠以去除非目标cfDNA，得到纯化后的捕获有目标cfDNA的生物素双探针链霉亲和素磁珠；S3、将纯化后的捕获有目标cfDNA的生物素双探针链霉亲和素磁珠加热变性，降温，孵育，离心，取上清，以回收得到目标cfDNA；所述生物素双探针链霉亲和素磁珠包括链霉亲和素磁珠、连接在所述链霉亲和素磁珠上的双生物素标记探针BP1、连接在所述链霉亲和素磁珠上的双生物素标记探针BP2；所述生物素双探针链霉亲和素磁珠的制备方法包括以下步骤：I、将所述链霉亲和素磁珠和盐缓冲液混合，得到链霉亲和素磁珠悬浮液，所述链霉亲和素磁珠和盐缓冲液的体积比为1:0.9-1.1；将所述双生物素标记探针BP1、双生物素标记探针BP2、四氧化三铁修饰生物素以及链霉亲和素磁珠悬浮液混合，使得所述双生物素标记探针BP1的终浓度为45-55μM，使得所述双生物素标记探针BP2的终浓度为45-55μM，使得所述四氧化三铁修饰生物素的终浓度为15-20μM；孵育后除去溶液，得到初始生物素双探针链霉亲和素磁珠；其中，所述探针BP1包括polyA和与靶标互补的短序列特异性结合序列A，所述探针BP2包括polyA和与靶标互补的短序列特异性结合序列B，所述短序列特异性结合序列A的序列为：CTCAACCAATAAAACCTACTCCTCC，所述短序列特异性结合序列B的序列为：CTAACTTTAAACRCTAACAAACGC；II、将所述初始生物素双探针链霉亲和素磁珠与pH1.2-1.85-6M的盐酸胍溶液混合并搅拌，依次以4-5M盐酸胍溶液、3-4M盐酸胍溶液、水置换pH1.2-1.85-6M的盐酸胍溶液，除水后，得到生物素双探针链霉亲和素磁珠。

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